Физиология

• Физиология микроорганизмов

Энергия в бактериальной клетке накапливается в форме молекул АТФ. У хемоорганотрофных бактерий реакции, связанные с получением энергии в форме АТФ, — это реакции окисления-восстановления, сопряженные с реакциями фосфорилирования.

При использовании в качестве источника углерода и энергии глюкозы или других гексоз начальные этапы окисления глюкозы яв­ляются общими, как при оксидативном, так и при бродильном метаболизмах. К ним относятся пути превращения глюкозы в пируват (при использовании в качестве источника энергии отличных от глюкозы гексоз, или дисахаридов, они в результате химических превраще­ний вступают в цепь реакций, превращающих глюкозу в пируват).

• Пути расщепления глюкозы.

• Расщепление глюкозы до пировиноградной кислоты, одному из важнейших промежуточных продуктов обмена веществ, у бактерий происходит 3 путями

• Пути расщепления глюкозы

1) через образование фруктозо-1,6-дифосфата (ФДФ-путем, или гликолитическим распадом, или, по имени изучавших его ис­следователей, путем Эмбдена—Мейергофа— Парнаса);

2) через пентозофосфатный путь (ПФ-путь);

3) через путь Энтнера—Дудорова, или КДФГ-путь (путь 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконовая кислоты).

Глюкоза в бактериальной клетке сначала фосфорилируется при участии АТФ и фермен­та гексокиназы до метаболически активной формы глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф), которая служит исходным соединением для любого из трех указанных выше путей.

• ФДФ-путь.

Г-6-Ф изомеризуется до фруктозо-6-фосфата, который под действием фосфофруктокиназы превращается во фруктозо-1,6-дифосфат, который в дальнейшем через образование З-фосфоглицеринового альдегида окисляется до пировиноградной кислоты.

Баланс окисления глюкозы по ФДФ-пути слагается из образования 2 молекул пирувата, 2 молекул АТФ и 2 молекул восстановленного НАД.

• ПФ-путь.

В этом случае глюкозо-6-фосфат через реакции дегидрирования и декарбоксилирования превращается в рибулезо-5-фосфат (Ри-5-Ф), который находится в равновесии с рибозо-5-фосфатом и ксилулозо-5-фосфатом. Ри-5-Ф расщепляется до З-фосфоглицеринового альдегида, промежуточного продукта превращения глюкозы в пируват.

Образовавшиеся пентозофосфаты превращаются в результате транскетолазных и трансальдолазных реак­ций во фруктозо-6-фосфат, замыкая реакции в цикл, и в 3-фосфоглицериновый альдегид, промежуточный продукт превращения глюкозы в пируват по ФДФ-пути.

При одном обороте цикла образуется 1 молекула З-фосфоглицеринового альдегида, 3 молекулы С0₂ и 2 молекулы восстановленного НАДФ.

• КДФГ-путь (путь Этнера—Дудорова)

Этот путь расщепления глюкозы специфичен только для бактерий. Встречается у бактерий, потерявших фермент фосфофруктокиназу, например у бактерий рода Pseudomonas.

Процесс начинается с дегидрирования глюкозо-6-фосфата до 6-фосфоглюконовой кислоты. От нее под действием дегидрогеназы отщепляется вода и образуется 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконовая кислота (КДФГ), которая расщепляется альдолазой на пируват и 3-фосфоглицериновый альдегид. Последний окисляется до пировиноградной кислоты так же, как и по ФДФ-пути.

На каждую молекулу глюкозы образуется 1 молекула АТФ, 1 молекула восстановленного НАД и 1 молекула восстановленного НАДФ, которая эквивалента 1 молекуле АТФ и 1 молекуле восстановленного НАД.

• Окислительный метаболизм у бактерий (дыхание)

• Окислительный метаболизм

Бактерии, обладающие окислительным метаболизмом, энергию получают путем дыхания.

Дыхание— процесс получения энергии в реакциях окисления-восстановления, сопряженных с реакциями окислительного фосфорилирования, при котором донорами электронов могут быть органические (у органотрофов) и неорганические (у литотрофов) соединения, а акцептором — только неорганические соединения.

В зависимости от акцепторов протонов и электронов среди бактерий различают аэробы, факультативные анаэробы и облигатные анаэробы. Для аэробов акцептором является кислород. Факультативные анаэробы в кислородных условиях используют процесс дыхания, в бескислородных – брожение. Для облигатных анаэробов характерно только брожение, в кислородных условиях наступает гибель микроорганизмов из-за образования перекисей, идет отравление клетки.

Облигатные аэробы (бруцеллы, легионеллы, псевдомонады, микобактерии, возбудитель сибирской язвы) растут и размножаются только в присутствии кислорода. Используют кислород для получения энергии путем кислородного дыхания. Они подразделяются на:

1) строгие аэробы (менингококки, бордетеллы), которые растут при парциальном давлении атмосферы воздуха;

2) микроаэрофилы (листерии) растут при пониженном парциальном давлении атмосферного возхдуха.

Облигатные анаэробы (бифидобактерии, лактобактерии, клостридии) не используют кислород для получения энергии. Тип метаболизма у них бродильный. Они подразделяются на:

1) строгие анаэробы – микроорганизмы для которых молекулярный кислород токсичен; он либо убивает микроорганизмы, либо ограничивает их рост. Энергию строгие анаэробы получают маслянокислым брожением;

2) аэротолерантные микроорганизмы (молочнокислые бактерии) используют кислород для получения энергии, но могут существовать в его атмосфере. Энергию получают гетероферментативным молочнокислым брожением

Факультативные анаэробы (пневмококки, энтерококки, энтеробактерии, коринебактерии, франциселлы) способны расти и размножаться как в присутствии кислорода, так и в отсутствии его. Они обладают смешанным типом метаболизма. Процесс получения энергии у них может происходить кислородным дыханием в присутствии кислорода, а в его отсутствии переключаться на брожение. Различное физиологическое отношение микроорганизмов к кислороду связано с наличием у них ферментных систем, позволяющих существовать в атмосфере кислорода. В окислительных процессах, протекающих в атмосфере кислорода образуются токсические продукты: перекись водорода Н₂О₂ и закисный радикал кислорода О₂^-. Для нейтрализации токсичных форм кислорода, микроорганизмы, способные существовать в его атмосфере, имеют защитные механизмы.

• У бактерий, обладающих окислительным метаболизмом, акцептором электронов (или водорода (Н⁺)) является молекулярный кислород. В этом случае пируват полностью окисляется в цикле трикарбоновых кислот до С₂.

• Цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса)

• 1 - цитрат-синтетаза;

• 2, 3 – аконитат-гидратаза

• 4 – изицитратдегидрогеназа

• 5 – изицитратдегидрогеназа

• 6 – оксоглютаратдегидрогеназа

• 7 – сукцинил-КоА-гидролаза

• 8 – сукцинатдегидрогеназа

• 9 – фумаратгидратаза

• 10 – малатдегидрогеназа

• ФП – флавопротеид.

Цикл трикарбоновых кислот выполняет функции как поставщика предшественников для биосинтетических процессов, так и атомов водорода, который в форме восстановленного НАД переносится на молекулярный кислород через серию переносчиков, обладающих сложной структурно оформленной мультиферментной системой — дыхательной цепью.

Дыхательная цепь у бактерий локализована в ЦПМ и во внутриклеточных мембранных структурах.

• Типичная цепь выглядит следующим образом:

ЦТК → НАД(Н₂)→флавопротеид→хинон → →цитохромы: в→с→а→О₂

Среди бактериальных цитохромов различают цитохромы в, с, а и а₃. Конечным этапом переноса электронов (протонов) по дыхательной цепи является восстановление цитохромов а - а₃ (цитохромоксидазы). Цитохромоксидаза является конечной оксидазой, передающей электроны на кислород.

Образующиеся при окислении ФАД или хинонов протоны связываются ионами О^2- с образованием воды.

Образование АТФ вдыхательной цепи связывают с хемоосмотическим процессом. Особая ориентация переносчиков в ЦПМ приводит к тому, что передача водорода происходит с внутренней на внешнюю поверхность мембраны, в результате чего создается градиент атомов водорода, проявляющийся в наличии мембранного потенциала. Энергия мембранного потенциала используется для синтеза локалиизованной в мембране АТФазой АТФ.

У некоторых бактерий цитохромы отсутствуют, и при контакте с кислородом происходит непосредственный перенос водорода на кислород с помощью флавопротеидов, конечным продуктом при этом оказывается перекись водорода — Н₂О₂.

• Помимо углеводов прокариоты способны использовать другие органические соединения, в частности белки, в качестве источника энергии, окисляя их полностью до СО₂ и Н₂О.

• Аминокислоты могут использоваться в конструктивном метаболизме, а могут у аммонифицирующих бактерий служить основным материалом в энергетических процессах при окислительном дезаминировании, в результате которого происходит выделение аммиака и превращение аминокислоты в кетокислоту, которая через цикл трикарбоновых кислот вступает в конструктивный метаболизм:

2R–CHNH₂ –СООН + О₂ →2R– СО –COOH + +2NH₃

• История

В соответствии с уровнем знаний о микробах, с появлением новых принципиальных открытий и методов, а также формированием новых направлений историю микробиологии можно разбить на пять периодов.

• Периоды становления микробиологии

• Эвристический период

• Этот период начинается с момента, когда Гиппократ (III—IV в. до н. э.) высказал догадку, предположение (эвристика—догадка, домысел) о том, что болезни, передающиеся от человека к человеку, вызываются какими-то невидимыми, неживыми веществами, образующимися в гнилых болотистых местах. Эти вещества он назвал «миазмами». Нужно сказать, что в древности, еще до открытия микробов, не зная об их существовании, люди пользовались плодами деятельности микробов — виноделием, пивоварением, сыроделием, выпечкой хлеба и т. д.

• Только в XV—XVI вв. итальянский врач и поэт Джералимо Фракасторо (1476—1553) обосновал мнение о том, что вызывают болезни «живые контагии», которые передают болезни через воздух или через предметы, что эти невидимые существа живут в окружающей среде и что для борьбы с болезнями, вызываемыми «живыми контагиями», необходима изоляция больного, уничтожение контагий, окуривание можжевельником и т. д. Кстати, Фракастора за эти его работы считают основоположником эпидемиологии.

• Таким образом, примерно за два тысячелетия ученые прошли путь от догадок и предположений к убеждению, что болезни человека вызываются какими-то невидимыми живыми существами.

• Морфологический период

• Этот период начинается с конца XVII — начала XVIII в., когда голландский естествоиспытатель Антоний ван Левенгук (1632—1723) открыл бак­терии. А. Левенгук родился и умер в маленьком голландском городке Делфте. Продавец сукна, он в свободное от работы время увлекался модной тогда в Голландии шлифовкой стекол и конструированием линз для микроскопов. Созданный им микроскоп увеличивал предметы в 150—300 раз. Рассматривая все подряд (воду, налет с зубов, испражнения, кровь, сперму и др.), Левенгук обнаружил множество живых «зверюшек», которых он назвал «анималькулюсы».

• Систематически делая зарисовки и описания «анималькулюсов», он направлял длинные письма с результатами своих наблюдений в Лондонское королевское научное общество. Эти письма сначала печатались в научных журналах, а потом, в 1695 г., были изданы на латинском языке отдельной большой книгой под названием «Тайны природы, открытые Антони ван Левенгуком при помощи микроскопов».

• Левенгук открыл и увидел мир микробов; и это положило начало так называемому морфологическому периоду в развитии микробиологии, который продолжается и до наших дней.

• После открытия Левенгука началось победное шествие микробиологии. Открывались все новые бактерии, грибы, простейшие, а в конце XIX в. были открыты вирусы. Однако длительное время не ясна была роль микробов в природе и в патологии человека. Чтобы доказать этиологическую роль микробов в патологии человека, велись исследования на животных, а также героические опыты по самозаражению.

• Следует отметить смелые опыты русского эпидемиолога Данилы Самойловича (1724-1810), который заразил себя отделяемым бубона больного человека чумой, в результате чего заболел, но, к счастью, остался жив. Исторически известен ряд таких же героических опытов по самозаражению материалами или культурами соответствующих возбудителей, взятыми от больного холерой (Петенкофер, И. И. Мечников, Д. К Заболотный, И. В. Савченко, Н.Ф.Гамалея), сыпным тифом (Г.Н. Минх, О. О. Мочутковский), чумой (В. П. Смирнов), вирусом полиомиелита (М. Н. Чумаков), вирусом гепатита А (М. С. Балоян) и др.

• Открытие все новых возбудителей инфекционных болезней продолжалось в течение XVIII—XX столетий и продолжается в наше время. Конец XIX в. ознаменовался открытием вирусов. В 1892 г русский ботаник Д. И. Ивановский (1864—1920) открыл новый мир микробов — царство вирусов (от лат. virus — яд). Наличие мельчайших частиц, проходящих через бактериальные фильтры и вызывающих специфические поражения, Д. И. Ивановский обнаружил при изучении мозаичной болезни табака. Затем были открыты многие вирусы, поражающие человека, животных, растения и бактерий. В первой половине XX в. оформилась самостоятельная дисциплина — вирусология, занимающаяся изучением вирусов.

• Физиологический период

• С момента обнаружения микробов, естественно, возник вопрос не только об их роли в патологии человека, но и об их устройстве, биологических свойствах, процессах жизнедеятельности, экологии и т. д.

• Поэтому с середины XIX в. началось ин­тенсивное изучение физиологии бактерий. Этот период, который начинался с XIX в. и продолжается до наших дней, условно был назван физиологическим периодом в развитии микробиологии.

• Большую роль в этот период сыграли работы выдающегося французского ученого Луи Пастера (1822—1895). Л. Пастер открыл: 1) природу брожения; анаэробиоз; 3) опроверг бытовавшую в его времена теорию самозарождения; 4) обосновал принцип стерилизации; 5) разработал принцип вакцинации и способы получения вакцин.

• Пастер сделал замечательное открытие, доказав, что брожение (молочнокислое, спиртовое, уксусное) — это биологическое явление, которое вызывается микробами, их ферментами, т. е. Пастер стал основоположником биотехнологии.

• Значительный вклад в развитие микробиологии в этот период внес немецкий бактериолог Роберт Кох (1843-1910), который предложил окраску бактерий, микрофотосъемку, способ получения чистых культур, а также знаменитую триаду, по­лучившую название триада Генле—Коха, по установлению этиологической роли микробов в инфекционном заболевании. Согласно этой триаде, для доказательства роли микроба в возникновении специфической болезни необходимо три условия: 1) чтобы микроб обнаруживался только у больного и не обнаруживался у здоровых людей и больных другими болезнями; 2) должна быть получена чистая культура микроба; 3) микроб должен вызвать аналогичное заболевание при заражении животных.

• Изучение биологических и физиологических свойств микроорганизмов, продолжавшееся с конца XIX в. и течение XX в. привело к познанию глубинных процессов жизнедеятельности бактерий, вирусов и простейших

• Иммунологический период

• Этот период в развитии микробиологии связан прежде всего с именами французского ученого Л. Пастера, российского биолога И. И. Мечникова (1843—1916) и немецкого химика Пауля Эрлиха (1854—1915). Этих ученых с полным правом можно назвать основоположниками иммунологии, так как Л. Пастер открыл и разработал принцип вакци­нации, И. И. Мечников — фагоцитарную теорию, которая явилась основой клеточной иммунологии, и П. Эрлих высказал гипотезу об антителах и развил гуморальную теорию иммунитета.

• Молекулярно-генетический период

• Развитие во второй половине XX в. молекулярной биологии, генетики, биотехнологии, генной и белковой инженерии, цитологии и других наук дало новый толчок к развитию микробиологии и иммунологии, особенно молекулярных и генетических аспектов этих наук. В этот период была расшифрована молекулярная структура многих бактерий и вирусов, строение и состав их генома, структура антигенов и антител, факторов патогенности бактерий и вирусов, а также факторов иммунной защиты

• Расшифровка генов бактерий и вирусов, их синтез позволили искусственно синтезировать рекомбинантные ДНК и получать на их основе с помощью генетической инженерии рекомбинантные штаммы бактерий и вирусов, которые нашли широкое применение в биотехнологии для получения разнообразных биологически активных веществ

• Генная инженерия в области иммунологии позволила получать вакцинные и диагностические препараты.

• Успешно решается проблема создания синтетических вакцин на основе антигенов или их детерминант, конъюгированных с полимерными носителями и адъювантами, а также живых векторных вакцин, полученных генно-инженерным способом.

• Достижения в микробиологии и иммунологии XX в. не только обеспечили успехи в борьбе с инфекционными болезнями, но и открыли новые пути и методы диагностики и терапии неинфекционных болезней, связанных с нарушениями в иммунной системе.

• Систематика и номенклатура микробов

• Микробы, или микроорганизмы (бактерии, грибы, простейшие, вирусы), систематизированы по их сходству, различиям и взаимоотношениям между собой. Этим занимается специальная наука — систематика микроорганизмов.

• Систематика включает три части:

• классификацию,

• Таксономию,

• идентификацию.

В основу таксономии (от греч. taxis — расположение, порядок) микроорганизмов положены их морфологические, физиологические, биохимические и молекулярно-биологические свойства.

• Различают следующие таксономические категории:

• В рамках той или иной таксономической категории выделяют таксоны — группы организмов, объединенные по определенным однородным свойствам.

• Названия микроорганизмов регламентируются Международным кодексом номенклатуры (зоологической, ботанической, номенклатуры бактерий, вирусов).

• Микроорганизмы представлены доклеточными формами (вирусы — царство Vira) и клеточными формами (бактерии, архебактерии, грибы и простейшие).

• По новому высшему уровню в иерархии классификации среди клеточных форм жизни различают 3 домена (или «империи»): «Bacteria»,

• «Archaea»,

• «Eukarya»

• Домены включают царства, типы, классы, порядки, семейства, роды, виды. Одной из основных таксономических категорий является вид (species).

• Вид — это совокупность особей, объединенных по близким свойствам, но отличающихся от других представителей рода.

• Совокупность однородных микроорганизмов, выделенных на питательной среде, характеризующихся сходными морфологическими, тинкториальными (отношение к красителям), культуральными, биохимическими и антигенными свойствами, называется чистой культурой.

• Чистая культура микроорганизмов, выделенных из определенного источника и отличающихся от других представителей вида, называется штаммом. Штамм — более узкое понятие, чем вид или подвид. Близким к понятию штамма является понятие клона. Клон представляет собой совокупность потомков, выращенных из единственной микробной клетки.

• микроорганизмы в зависимости от характера различий обозначают как морфовары (отличие по морфологии), резистентовары (отличие по устойчивости, например, к антибиотикам), серовары (отличие по антигенам), фаговары (отличие по чувствительности к бактериофагам), биовары (отличие по биологическим свойствам), хемовары (отличие по биохимическим свойствам) и т. д.

• Для идентификации и типирования бактерий используют фенотипические, генотипические и филогенетические показатели:

• ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ: окраска по Граму, морфологические и культуральные свойства, биохимические реакции, хромогенные ферментативные реакции, использование источников углевода, антибиотикограмма, бактериоцинотипирование, фаготипирование, антигенные свойства, химический состав клеточной стенки (пептидогликан, миколовая кислота и др.), а также белков и липидов клетки.

• ГЕНОТИПИЧЕСКИЕ: соотношение G+C, гибридизация ДНК, молекулярное зондирование, плазмидный анализ, полиморфизм длины фрагментов рестрикции ДНК, риботипирование.

• ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ: анализ рРНК-последовательности, РНК-РНК-гибридизация, амплификация полиморфной ДНК с использованием производных праймеров, секвенирование 16S и 23S рРНК.

Питание

• Под питанием понимают процессы поступления и выведения питательных веществ в клетку и из клетки. Питание в первую очередь обеспечивает размножение и метаболизм клетки.

• Среди необходимых питательных веществ выделяют: углерод, кислород, водород, азот, фосфор, калий, магний, кальций.

• Кроме органогенов, необходимы микроэлементы. Они обеспечивают активность ферментов. Это цинк, марганец, молибден, кобальт, медь, никель, вольфрам, натрий, хлор.

• Для бактерий характерно многообразие источников получения питательных веществ.

В зависимости от источника получения углерода бактерии делят на:

• 1) аутотрофы (используют неорганические вещества – СО₂);

• 2) гетеротрофы (используют органические С-гексозы, многоатомные спирты, аминокислоты).

Процессы питания должны обеспечивать энергетические потребности бактериальной клетки. По источникам энергии микроорганизмы делят на:

• 1) фототрофы – источник солнечная энергия;

• 2) хемотрофы – получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций;

• 3) хемолитотрофы – используют неорганические соединения;

• 4) хемоорганотрофы – используют органические вещества.

Медицинская микробиология изучает бактерии, которые являются гетерохемоорганотрофами.

По степени гетеротрофности микроорганизмы делятся на:

• 1) сапрофиты – питаются мертвым органическим материалом;

• 2) паразиты – питаются за счет макроорганизма. Облигатные паразиты полностью лишены возможности жить вне клеток (риккетсии, хламидии, вирусы). Факультативные паразиты могут жить и без хозяина, т.е. вне организма – на простых питательных средах.

Факторами роста бактерий являются витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, присутствие которых ускоряет рост. Среди бактерий выделяют:

• 1) прототрофы (способны сами синтезировать необходимые вещества);

• 2) ауксотрофы (нуждаются в факторах роста).

• Микроорганизмы ассимилируют питательные вещества в виде небольших молекул, поэтому белки, полисахариды и другие биополимеры могут служить источниками питания только после расщепления их экзоферментами до более простых соединений.

• Транспорт веществ

• Для того, чтобы питательные вещества могли подвергнуться превращениям в цитоплаз­ме клетки, они должны проникнуть в клетку через пограничные слои, отделяющие клетку от окружающей среды. Ответственность за поступление в клетку питательных веществ лежит на ЦПМ.

• Существует два типа переноса веществ в бактериальную клетку: пассивный и активный.

При пассивном переносе вещество проникает в клетку только по градиенту концентрации. Затрат энергии при этом не происходит.

Различают две разновидности пассивного переноса: