Лекция 5. Получение трансгенных мышей Введение

Получение трансгенных мышей поразительно быстро стало почти рутинным методом. Впервые трансгенные мыши были получены путем инфицирования предимплантационных эмбрионов ретровирусами , но затем в большинстве лабораторий стали, использовать для этого прямую микроинъекцию клонированной ДНК в один из пронуклеусов на стадии зиготы. Введение ген­ной конструкции в живой организм значительно информативнее, чем любой анализ, проводимый на уровне систем клеточного культивирования, так как дает возможность проследить функционирование гена в условиях нормальной физиологии и в процессе развития. Мы не будем останавливаться на многочисленных возможностях, предлагаемых системой трансгенной мыши. В этой теме внимание сфокусировано на технике инъекции ДНК в пронуклеус. Кроме того, затронута проблема переноса генов с помощью ретровирусов в предимплантационные эмбрио­ны и эмбриональные стволовые клетки (ЭС клетки) для получения животных трансгенных линий.

1. Основная техника

1.1. Получение линейных днк и удаление последовательностей вектора

Клонированные ДНК, используемые для микроинъекций должны быть в линеаризованной форме. Кроме того, из них необходимо удалить как можно большую часть вектора. Линей­ные ДНК характеризуются в 5 раз большей частотой интеграции по сравнению с кольцевыми молекулами. Хотя присут­ствие векторных последовательностей и не влияет на частоту интеграции ДНК, оно снижает последующую экспрессию трансгена почти в 1000 раз. Вот почему при клонировании и конструировании гена следует заранее предусмотреть способ удаления векторных последовательностей. Сейчас в распоряже­нии исследователей имеются удобные векторы, несущие в своих полилинкерных последовательностях сайты для разрезания редкими рестриктазами, такими, как Not1 и Sfi1. Однократное воздействие такими ферментами позволяет чисто вырезать из вектора большие вставки.

1.2. Выделение фрагментов днк и их очистка

Существует ряд методов, позволяющих получать фрагменты ДНК. Для целей микроинъекции важнейшее значение имеет их чистота. Особенно важно, чтобы образцы ДНК не были за­грязнены органическими растворителями, способными оказать губительное воздействие на развитие зиготы. Рекомендуются методики, которые исключают применение фенола, хлороформа или эфира. Процедура подразумевает очистку фрагмента ДНК в агарозе с низкой точкой плавления (BRL) и последующее прямое выде­ление ДНК из геля с помощью препаративной ионобменной колоночной хроматографии.

1.3. Линии мышей

Выбор линии зависит от того, имеет ли ее генетический фон прямое отношение к предполагаемому использованию трансген­ных мышей. Например, анализ некоторых конструкций иммуноглобулиновых генов или генов главного комплекса гистосовместимости (МНС) в большой степени облегчается для линий с определенным генетическим фоном. При этом значительно удобнее инъецировать ДНК непосредственно в яйца, чем вводить трансген в соответствующую линию с помощью скрещива­ний. В некоторых случаях скрещивания могут оказаться необходимыми, так как существуют инбредные линии, не способные к суперовуляции, а следовательно, не обеспечиваю­щие достаточное для микроинъекции число яиц на самку. Кроме того, есть линии мышей, яйца которых культивировать очень трудно. Все эти параметры следует учесть при выборе.