1. Исследование на наличие патогенного стафилококка
Патогенный стафилококк грамположителен, обладает гемолитическими свойствами, плазмокоагуляцией, сбраживает маннит с образованием газа и при вну-трикожном введении кролику вызывает некроз на месте инъекции. Из всех перечисленных свойств патогенного стафилококка свойство коагулировать плазму крови" является обязательным.
Определение гемолитических свойств. Патологический материал высевают на кровяной агар в три чашки Петри. В первую чашку вносят 0,1—0,2 мл молока или суспензии, растертого органа. Нанесенный на среду посевной материал распределяют равномерно по поверхности шпателем или согнутой пастеровской пипеткой, а затем, не обжигая их, делают дробные пересевы на 2-ю и 3-ю чашки. Посевы инкубируют в термостате при 37 °С в течение 18—24 часов.
Выросшие на среде круглые серо-белые влажные колонии с ровными краями, образующие зону гемолиза, вызывают подозрение на наличие патогенного стафилококка. Из такой колонии делают мазок и окрашивают по Граму (стафилококки под микроскопом имеют вид виноградной грозди или кучек, состоящих из нескольких кокков), а также пересевают на МПА, содержащий 0,2 % глюкозы, и МПБ для получения чистой культуры и изучения свойств.
Реакция плазмокоагуляции. 8 мл свежеполученной крови кролика смешивают с 2 мл 5%-ного раствора лимоннокислого натра. Плазму, полученную после центрифугирования этой смеси, отсасывают и разводят 1:4 физиологическим раствором, разливают по 0,5 мл в пробирки, количество которых соответствует числу проб, и вносят в каждую пробирку пипеткой по 0,1 мл суточной бульонной культуры стафилококка и ставят в термостат при температуре 37 °С Посевы просматривают чергз 2, 3, 5, 18 и 24 часа. Для контроля плазму оставляют без культуры. В случае положительной реакции плазма свертывается, образуя желеобразный сгусток, при отрицательной ■— плазма остается жидкой.
Ферментация маннита. 2—3 капли испытуемой бульонной культуры стафилококка засевают в бульон, содержащий 0,5 % маннита и индикатор Андрадэ. Можно также пользоваться готовой полужидкой сухой средой с маннитом и индикатором ВР. Засеянные пробирки заливают стерильным вазелиновым маслом слоем до 1 см, выдерживают 48 часов в термостате при температуре 37 °С. Изменение цвета индикатора и появление пузырьков газа в бродильной трубочке бульона или в толще полужидкого агара указывает на разложение маннита.
Дермонекротическая проба. Суточную культуру смывают с МПА стерильным физиологическим раствором. Концентрацию микробной взвеси доводят по оптическому стандарту до 2 миллиардов микробных тел в 1 мл. В опыт берут кроликов массой 2,5—3 кг. Волосы на боку кролика выстригают, в толщу кожи вводят 0,2 мл культуры (при правильном введении на месте инъекции образуется заметный инфильтрат). Учет результатов проводят ежедневно в течение 5 суток. Положительной реакцией считают появление некроза на месте инъекции. Гиперемия и инфильтра-Ция без некроза рассматривается как отрицательная реакция.
2. Исследование на наличие бактерий маститидис овис
Молоко или суспензию из растертого кусочка вымени высевают по 0,1 мл дробно на сывороточный или кровяной агар в три чашки Пегри и инкубируют 24 часа при температуре 37 °С. Бактерии маститидис овис, выросшие на этих средах, образуют мелкие округлые голубоватые колонии диаметром 1—2 мм. Через 3—5 дней колонии приобретают сероватый оттенок и вокруг них возникает' слизистый ободок. В мазках, окрашенных по Граму, обнаруживают маленькие (1—2 микрометра длины и до 0,5 микрометра толщины) грамотрица1ельные палочки с округленными краями. При окраске Лефлеровской синькой некоторые палочки окрашиваются биполярно. Микроб спор не образует, неподвижен. Колонии отвивают на пробирки с сывороточным агаром. Выросшую культуру микроскопируют и засевают на сывороточный бульон, на среды с углеводами и многоатомными спиртами, в желатин, молоко и пептонную воду (для образования индола). На простом бульоне эти бактерии растут скудно, образуют легкую муть, на сывороточном — более интенсивно. Через 3— 5 дней бульон просветляется и на дне образуется слизистый осадок. На желатине при комнатной температуре роста не дают, молоко не свертывают, большинство штаммов индола не образует. Ферментация углеводов — непостоянный признак. Однако большинство штаммов образует кислоту на средах с глюкозой, сахарозой, мальтозой, ксилозой, сорбитом и не сбраживают лактозу, арабинозу, раффинозу и дульцит. Для лучшего роста возбудителя среды с углеводами готовят на полужидком агаре.
Бактериум маститидис овис убивает белых мышей на 4—5-е сутки при подкожном введении им 0,2—0,5 мл суточной бульонной культуры. Внутрибрюшинное заражение бульонной культурой в количестве 1—2 мл вызывает гибель морских свинок на 3—4-е сутки, кроликов на 5—6-е.
3. В лаборатории выделенные чистые культуры возбудителей мастита проверяют на их чувствительность к антибиотикам согласно «Методическим указаниям по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных».
Приготовление питательных сред для выращивания бактериум маститидис овис
Кровяной и сывороточный агар. Мясопептонный агар рН 7,4—7,6 растапливают и охлаждают до 50 °С. Добавляют 5 % дефибрированной крови или сыворотки барана, крупного рогатого скота или кролика, смешивают и разливают по чашкам.
Сывороточный бульон. В мясо-пептонный бульон рН 7,4—7,6 добавляют 5 % сыворотки крови барана или крупного рогатого скота и стерильно разливают по пробиркам.
Полужидкие среды с углеводами. В 1%-ную пептонную воду рН 7,4—7,7 добавляют 0,15 % агара, 0,5 % соответствующего углевода и 1 % индикатора Андраде, разливают по пробиркам и стерилизуют при 0,5 атмосферы 30 минут.