18. Основные этапы проведения тестирования антибиотикочувствительности, интерпретация результатов исследования.
Первым этапом исследования является определение минимальной ингибирующей рост концентрации (МИК) используемого антибиотика с бактерицидным механизмом действия (например, бензилпенициллина) в отношении испытуемого штамма бактерий. Исследование проводят методом серийных разведении. После учета МИК антибиотика приступают ко второму этапу - определению минимальной бактерицидной концентрации антибиотика (МБК). Для этого из всех пробирок с антибиотиком, в которых отсутствует визуально рост бактерий, делают высев по 0,1 мл на отдельные чашки с питательной средой (агар Хоттингера, МПА или 5% кровяной агар) и инкубируют при 35-37°С 18-24 ч. Определяют минимальную бактерицидную концентрацию антибиотика (МБК) по первой пробирке с антибиотиком, высев из которой не дал роста колоний бактерий. Для выявления толерантности бактерий к антибиотику сопоставляют его МИК и МБК. Испытуемый штамм бактерий считается толерантным к антибиотику если это соотношение 32.
Ускоренные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
В практике лабораторий ускоренное определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам осуществляется некоторыми зарубежными автоматизированными системами микробиологических исследований (MS-2, Qantum 2, Sceptor и др.). В кюветах панели содержатся дегидрированные субстраты или диски с антибиотиками. Каждый антибиотик в кювете представлен в одной концентрации, соответствующей критерию принадлежности бактерий к группе "чувствительных" к антибиотику. Одновременно тестируется 20 и более антибиотиков. После внесения взвеси испытуемых бактерий посевы инкубируют при 35-37°С в течение 4-5 ч. Результаты регистрируют спектрофотометрически или кондуктометрически сразу при появлении размножения бактерий в контроле без антибиотика.
Для ускоренного определения чувствительности или устойчивости бактерий к бета-лактамным антибиотикам широко используются различные методы выявления бета-лактамазной активности бактерий. Представляем один из методов определения бета-лактамазы бактерий (Сиволодский Е.П., 1980). На фильтровальную бумагу (2х2 см) в чашке Петри наносят одну каплю 2% раствора водорастворимого крахмала. После ее впитывания наносят петлей в центр бумаги агаровую культуру испытуемых бактерий (например, стафилококков) и растирают в виде бляшки диаметром 3-4 мм. На поверхность бляшки наносят одну каплю (0,05 мл) рабочего йодного раствора бензил-пенициллина. После экспозиции 10 мин при комнатной температуре учитывают результаты реакции. Наличие бета-лактамазы: на темно-синем фоне четкая зона полного просветления вокруг бляшек бактерий. Отсутствие бета-лактамазы: на темно-синем фоне нет зоны просветления вокруг бляшки, края бляшки нечеткие, сливаются с фоном. Наличие бета-лактамазы указывает на устойчивость бактерий к антибиотику.
Реактивы на бета-лактамазу: реактив №1 - 0,005-молярный раствор йода (йод -1,27 мг/мл, калия йодид -15 мг/мл; 1/15 -молярный фосфатный буфер рН 6,5 до необходимого объема); реактив №2 - 2% раствор водорастворимого крахмала; реактив №3 - рабочий йодный раствор бензилпенициллина (во флакон, содержащий 500 000 ED бензилпенициллина, вносят 10 мл реактива № 1), годен в течение 2 ч.
Методом определения ESBL-продуцирующих штаммов. Поскольку при тестировании таких штаммов значения МПК цефалоспоринов III-IV поколений не всегда достигают уровня резистентности (8-16 мл), возникает необходимость использования специальных методов диагностики ESBL [3]. Применяемые с этой целью фенотипические тесты основаны на эффекте подавления активности ESBL в отношении оксиимино-β-лактамов в присутствии клавулановой кислоты.
Метод «двойных дисков» представляет вариант классического дискодиффузионного метода определения чувствительности, который позволяет обнаружить продукцию ESBL по наличию расширенной зоны подавления роста вокруг диска с цефалоспорином III поколения, например цефтазидимом, расположенного на расстоянии 20-30 мм от диска, содержащего клавулановую кислоту, обычно в виде комбинации амоксициллин/клавуланат (рис. 3).
Известные модификации данного метода, повышающие эффективность детектирования ESBL, включают использование дисков с различными оксиимино-β-лактамами, а также их размещение на разном удалении от диска, содержащего ингибитор.
Прямое сравнение уровней устойчивости к цефалоспоринам расширенного спектра и их комбинациям с клавулановой кислотой, используемое в ряде коммерчески доступных диагностических систем, обеспечивает более объективную оценку продукции ESBL.
19. Интегральный контроль качества определения чувствительности.
20. Классификация антибактериальных препаратов. Антибактериальная активность. Бактерицидные препараты. Бактериостатические препараты. Спектры действия антибактериальных препаратов.