17. Общая характеристика методов определения лекарственной чувствительности микроорганизмов (метод серийных разведений, диско-диффузионный, е-тест).

Современные стандартизованные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП подразделяют на методы серийных разведений и диффузионные.

Методы серийных разведений основаны на прямом определении основного количественного показателя, характеризующего микробиологическую активность АБП - величины его минимальной подавляющей концентрации (МПК).

МПК - минимальная концентрация, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма в бульонной культуре или на плотной среде.

Для определения МПК заданные концентрации АБП вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма и после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.

В зависимости от характера используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или в бульоне. В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных макро- и микроразведений.

Разновидностью метода серийных разведений является также метод, основанный на использовании только двух концентраций АБП, соответствующих пограничным значениям МПК (см. ниже). Этот принцип исследования широко используется в автоматизированных системах для определения чувствительности микроорганизмов.

Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диффузии АБП из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация АБП превосходит МПК.

В настоящее время существуют две основные модификации диффузионного метода: диско-диффузионный и Е-тест.

В диско-диффузионном методе в качестве носителя АБП используют бумажный диск. Образование зоны подавления роста происходит в результате диффузии АБП из носителя в питательную среду. В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК. Однако диско-диффузионный метод позволяет лишь косвенно судить о величине МПК, а результатом исследования является отнесение микроорганизма к одной из категорий чувствительности (чувствительный, промежуточный или резистентный).

Е-тест представляет собой узкую полоску полимера (0,5 x 6,0 см), на которую нанесен градиент концентраций АБП (от минимальных до максимальных). Подавление роста микроорганизма вокруг полоски Е-теста происходит только в той зоне, где концентрация АБП, диффундирующего из носителя, выше МПК, при этом образуется каплевидная зона ингибиции. Значения концентрации АБП в каждом участке носителя типографским способом нанесены на наружной (обращенной к исследователю) поверхности Е-теста. Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны подавления роста вплотную подходит к носителю.

Определение чувствительности бактерии к антибиотикам методом серийных разведении антибиотика в питательной среде

Метод разведения антибиотиков в бульоне. Для исследования используют бульоны Хоттингера или мясо-пептонный с содержанием 1,2-1,4 г/л аминного азота, рН 7,2-7,4. Можно использовать специальные среды, например бульон Мартена для дифтерийных микробов, жидкую среду Сабуро для грибов и др. Для испытания чувствительности бактерий к сульфаниламидным препаратам применяют особые синтетические среды. Для приготовления основных растворов антибиотиков их порошок взвешивают и растворяют в стерильной дистиллированной воде так, чтобы получить определенную удобную концентрацию, например 2000 мкг/мл (ED/мл). Некоторые антибиотики предварительно растворяют в этаноле, диметилсульфоксиде, а затем разводят стерильной дистиллированной водой. Основные растворы антибиотиков пригодны к использованию при хранении в холодильнике в течение недели.

Разведения антибиотиков готовят путем разбавления основного раствора антибиотика бульоном в диапазоне, определенном критериями антибиотикочувствительности. Например, для двукратных разведений антибиотика в диапазоне от 0,25 до 128 ED/мл используют 11 пробирок, в которые, кроме первой пробирки, вносят по 1 мл бульона. В первую пробирку вносят 2 мл раствора антибиотика с концентрацией 256 ED/мл, полученного путем предварительного разведения 2 мл основного раствора антибиотика 2000 ED/мл в 13.62 мл бульона. Затем отдельными пипетками переносят по 1 мл раствора антибиотика из первой пробирки в каждую последующую. Из предпоследней пробирки 1 мл смеси удаляют, в последнюю пробирку антибиотик не добавляют (контроль). Испытуемые микроорганизмы, суточную бульонную или агаровую культуру разводят бульоном до 105-106микробных тел в 1 мл и вносят по 1 мл во все пробирки с разведениями антибиотика и в контрольную. Следовательно, концентрация антибиотика в пробирках уменьшается в 2 раза. Посевы инкубируют при 37°С до появления роста в контроле. Отмечают первую пробирку с задержкой роста микробов. Концентрация антибиотика в этой пробирке является минимальной ингибирующей рост для испытуемого штамма микроба (МИК в ED/мл или мкг/мл).

Метод разведении антибиотиков в питательном агаре. Для исследования используют агар Хоттингера или мясо-пептонный агар с содержанием 1,2-1,4 г/л аминного азота, 1-2% агара, рН 7,2-7,4. При необходимости в агар добавляют 5%дефибринированной крови. На среде агар Mueller - Hinton 2 можно испытывать чувствительность к антибиотикам и сульфаниламидам. Для определения чувствительности к сульфаниламидам следует применять особые синтетические среды. Питательный агар расплавляют и разливают в стерильные колбы по числу изучаемых концентраций антибиотика, например, в диапазоне от 0,25 до 128 ED/мл используют 11 колб (одна колба для контроля без антибиотика). В первую колбу вносят 37,44 мл МПА, в остальные - по 20 мл. Затем в первую колбу добавляют 2,56 мл основного раствора антибиотика с концентрацией 2000 ED/мл. Концентрация препарата в колбе будет 128 ED/мл. Переносят мерным стерильным цилиндром последовательно из первой колбы во вторую и так далее по 20 мл МПА с антибиотиком и получают ряд двукратных разведении. В последнюю колбу антибиотик не добавляют (контроль). Содержимое каждой колбы быстро выливают в чашку Петри. Чашки с застывшим МПА с антибиотиком используют сразу. Испытуемые микроорганизмы, суточные бульонные или агаровые культуры, разводят бульоном до концентрации 107 микробных тел в 1 мл. Культуру засевают петлей или штампом-репликатором. На каждую чашку наносят по секторам или квадратам 12-24 испытуемых штамма. Посевы инкубируют при 37°С 18-24 ч и более до появления роста в контроле (без антибиотика). Для каждого штамма отмечают первую чашку с полной видимой задержкой роста микробов. Концентрация антибиотика в питательном агаре этой чашки является минимальной ингибирующей рост концентрацией для испытуемого штамма микроорганизма (МИК в ED/мл или мкг/мл).