Титриметрические методы

Титриметрические методы для определения активности липазы в крови были первыми методами, которые стали использовать в практических лабораториях. Метод, предложенный I. Cherry и I. Crandall, ставший позднее классическим, был основан на количественном определении жирных кислот, высвободившихся после инкубации образца сыворотки в течение 24 ч при 37 °C с 50% эмульсией оливкового масла в фосфатном буферном растворе при pH 7,0, титрованием 0,05 н. раствором NaOH с фенолфталеином в качестве индикатора [27].

Титриметрические методы вскоре были вытеснены методами, основанными на измерении величины рН инкубационной среды после завершения реакции. Позднее измерение pH стали проводить в варианте метода непрерывной регистрации с использованием чувствительного pH-метра, позволяющего при нормальной активности фермента фиксировать изменения pH инкубационной среды менее 0,02 ед. В данной процедуре использовали в качестве субстрата оливковое масло без добавления желчных кислот или колипазы. Поскольку реакция протекает достаточно быстро, для большинства образцов сыворотки достаточно 3-минутной инкубации [28].

Высокая чувствительность методов непрерывной регистрации, основанных на рН-метрии, позволила укоротить инкубационный период и снизить возможность инактивации фермента в течение инкубационного периода. Метод, предложенный Tietz и Repique в 1973 г., позднее ими же модифицированный, основан на поддержании значения рН среды инкубации в пределах 9,0 при 30 °С путем добавления титрованного раствора NaOH. Количество использованной щелочи, отнесенное ко времени, использовалось для расчета активности липазы. Была достигнута достаточная точность при использовании 100 мкл сыворотки крови при коротком времени реакции — от 3 до 8 мин. При использовании в качестве субстрата оливкового масла при 30 °С верхние значения референтного интервала были ниже 235 ед./л; с триолеином в качестве субстрата были получены несколько более высокие значения, верхний предел референтного интервала составлял 258 ед./л [29]. По мнению многих авторов, методы определения активности липазы в сыворотке крови, основанные на pH-метрии, являются точными, быстрыми и простыми в исполнении и могут считаться в настоящее время своеобразным золотым стандартом, с которым необходимо сравнивать все другие методы определения активности липазы. Увеличение концентрации колипазы и желчных солей, режим непрерывной регистрации привели к повышению воспроизводимости метода [28].

Турбидиметрические методы

Эмульсия липидов в воде имеет «молочный» внешний вид, так как мицеллы поглощают и рассеивают падающий свет. По мере гидролиза триглицеридов происходит просветление эмульсии, поскольку нарушается мицеллярное строение частиц. Приготовление и сохранение устойчивых и стабильных субстратов с соответствующими параметрами является достаточно сложной задачей; высокая исходная величина поглощения может приводить к значительной аналитической ошибке. Несмотря на многие теоретические и практические возражения, турбидиметрические методы определения активности липазы пользуются популярностью, особенно после их оптимизации [31].

Недостаток турбидиметрического метода сводится к отсутствию линейности на ранней стадии реакции в некоторых образцах сыворотки крови пациентов с высокой концентрацией ревматоидного фактора.