Бактериоскопическое исследование

Из исследуемого материала готовят мазки и окрашивают по Граму. В положительном случае обнаруживают кокки. Дифференцирование стафилококков, стрептококков и гонококков проводится на основании взаимного расположения клеток, локализации их внутри или вне лейкоцитов, окраски по Граму. Стафилококки и стрептококки являются грамположительными кокками, которые располагаются, как правило, вне лейкоцитов. Гонококки — грамотрицательные диплококки бобовидной формы (0,96—1 мкм) располагающиеся внутри лейкоцитов (рис. 83). Положительный бактерирскопический диагноз ставится в основном при острой форме гонореи до применения антибиотиков. При хронической гонорее бактериоскопическое исследование часто дает отрицательный результат.

Бактериологический метод: наиболее достоверный, так как часто встречаются хронические и латентные формы течения.

Для провокации (обострения) процесса с целью диагностики и лечения используется гоновакцина (взвесь убитых гонококков)

Микробиологическая диагностика туберкулеза

Возбудители туберкулеза — Mycobacterium tuberculosis, М. bovis — являются кислотоустойчивыми бактериями, характеризующимися медленным ростом на питательных средах. Заражение происходит воздушно-капельным путем, иногда через ЖКТ.

Материал для исследования: мокрота, экссудат, гной, промывные воды бронхов, желудка, ликвор, моча. Для консервации и ингибиции сопутствующей микрофлоры патологический материал перед транспортировкой в лабораторию обрабатывают 10% раствором фосфата натрия.

!!!Бактериоскопическое исследование.

Мокроту помещают в чашки Петри и ставят на черную поверхность. Петлей выбирают гнойный комочек, переносят его на предметное стекло и готовят мазок.

Ликвор отстаивают в холодильнике и готовят мазки из нежной пленки фибрина, в которой находятся микобактерий туберкулеза и клеточные элементы.

Мочу центрифугируют и делают мазки из осадка. Препараты из мочи обязательно обесцвечивают не только кислотой, но и спиртом для дифференциации микобактерий туберкулеза от М. smegmatis, которые могут находиться в мочё здоровых людей (они обесцвечиваются спиртом).

Мазки окрашивают по Цилю — Нельсену и микроскопируют, просматривая до 100 полей зрения в препарате. Микобактерии туберкулеза окрашиваются в ярко-красный цвет, располагаются поодиночке или небольшими скоплениями. Единичные бактерии можно обнаружить в препарате, если их содержание не менее 105 в 1 мл мокроты. Поэтому при небольшом содержании микобактерий туберкулеза в материале применяют методы «обогащения» — гомогенизации и осаждения или флотации.

Метод гомогенизации и осаждения.

К суточной порции мокроты добавляют равный объем 1%раствора едкого натра (или антиформина) для гомогенизации, флакон плотно закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение 10—15 мин После центрифугирования и нейтрализации кислотой из осадка готовят мазки и окрашивают по Цилю — Нельсену.

Метод флотации. Мокроту гомогенизируют и прогревают при 55°С в течение 30 мин на водяной бане. Затем добавляют 1—2 мл ксилола, дистиллированную воду, повторно встряхивают в течение 10 мин и отстаивают 20 мин при комнатной температуре. На поверхности образуется пена, состоящая из всплывших капелек ксилола с адсорбированными микробами. Из пенообразного слоя готовят мазок, несколько раз наслаивая материал на предметное стекло по мере его высыхания. Мазок обезжиривают эфиром, фиксируют нагреванием и окрашивают по Цилю—Нельсену.

Применение люминесцентной микроскопии повышает число находок микобактерий туберкулеза в патологическом материале.

Микроскопическое исследование является ориентировочным и позволяет судить лишь о наличии кислотоустойчивых бактерий в материале без определения видовой и типовой принадлежности.

Бактериологическое исследование. Для посева используют предварительно обработанный Na3PО4 исследуемый материал; необработанный материал непосредственно перед посевом в течение нескольких минут подвергают действию 10% серной кислоты или 4 — 6% раствора едкого натра для освобождения от сопутствующей микрофлоры, затем тщательно встряхивают и центрифугируют. Осадок нейтрализуют и засевают на несколько пробирок со средой Левенштейна — Иенсена (суспензия свежих яиц, картофельной муки, глицерина, аспарагина, сульфата и цитрата магния и малахитового зеленого) или другими специальными средами. Среду свертывают в наклонном положении при 85°С в течение 45 мин. Посевы инкубируют при 37°С 4—6 нед и более, так как микобактерий туберкулеза размножаются очень медленно, особенно в первых генерациях. Культуры этих микобактерий имеют вид сероватого или светло-кремового морщинистого или крошкообразного сухого налета.

Из биохимических свойств чаще всего определяют способность исследуемой культуры синтезировать никотиновую кислоту (ниациновая проба Конно). Это один из важных признаков, с помощью которого удается отличить Mycobacterium tuberculosis, хорошо синтезирующие никотиновую кислоту, от палочек М. bovis, образующих ее в минимальных количествах.

Для ускорения диагностики используют метод микрокультур Прайса. На нескольких предметных стеклах (ближе к одному концу) делают толстые мазки из исследуемого материала. Мазки высушивают, обрабатывают несколько мин 2—6% серной кислотой и нейтрализуют. Затем стекла опускают во флаконы с гемолизированной цитратной кровью в разведении 1:4—1:8 и ставят в термостат. Через 7 — 14 дней извлекают стекла, фиксируют препарат, окрашивают по Цилю — Нельсену и микроскопируют —вирулентные штампы образуют микрокультуры, имеющие вид жгутов или кос (корд-фактор).

Определение чувствительности микобактерий туберкулеза к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам проводят методом серийных разведений.

С этой целью по 0,1 мл взвеси микобактерий туберкулеза засевают в пробирки со средой Левенштейна — Иенсена, содержащей различные концентрации антибактериальных препаратов первого и второго ряда: 5, 10, 50 мкг/мл стрептомицина; 5, 10, 50, мкг/мл ПАСК; 1, 5, 10, 25 мкг/мл тубазида; 30 мкг/мл циклосерина и этионамида. Учитывают результаты на 12 —21-й день инкубации. Клинические границы устойчивости микобактерий туберкулеза: стрептомицин — 5 мкг/мл, ПАСК —10 мкг/мл, тубазид — 1 мкг/мл, циклосерин и этионамид — 30 мкг/мл.

Биопроба. Применяется при первичной диагностике с целью выделения чистой культуры микобактерий туберкулеза из органов животного, зараженного исследуемым материалом, а также для определения вирулентности этих микобактерий.

Исследуемый материал обрабатывают серной кислотой для освобождения от посторонней микрофлоры, нейтрализуют и вводят подкожно в количестве 2—3 мл морской свинке с отрицательной туберкулиновой реакцией. Через 4 мес, если животное не погибнет, его забивают, проводят макро- и микроскопическое исследование органов и делают посевы. М. tuberculosis высокопатогенны для морских свинок и малопатогенны для кроликов, М. bovis непатогенны для морских свинок и кроликов.