Тема заняття № 3. Дослідження регуляції ферментних процесів. Ензимопатії. Ензимодіагностика.

Теоретичні питання:

1. Активація та інгібування ферментів.

• активатори ферментів;

• інгібування ферментів (зворотне, незворотне, конкурентне, неконкурентне).

2. Основні два принципи регуляції швидкості ферментативних реакцій:

   1. Регуляція шляхом зміни каталітичної активності ферментів.

• алостеричні ферменти;

• ковалентна модифікація ферментів;

• протеолітична активація ферментів (обмежений протеоліз);

• дія регуляторних білків;

• циклічні нуклеотиди в регуляції ферментативних процесів.

1. Регуляція шляхом зміни кількості ферментів.

• конститутивні та адаптивні ферменти.

3. Ізоферменти, множинні молекулярні форми ферментів.

4. Ензимодіагностика, ензимопатії та ензимотерапія.

5. Ізоферменти в ензимодіагностиці.

6. Зміни активності ферментів плазми та сироватки крові як діагностичні (маркерні) показники розвитку патологічних процесів:

• інфаркт міокарду;

• захворювання печінки;

• захворювання м’язової тканини.

7. Природжені (спадкові) та набуті вади метаболізму, їх клініко-лабораторна діагностика.

8. Використання інгібіторів ферментів в якості лікарських засобів:

• ацетилсаліцилова кислота;

• алопуринол;

• сульфаніламідні препарати.

9. Ензимотерапія - використання ферментів в якості лікарських засобів

Практична робота

Завдання 1.Дослідити вплив фосфаколу та іонів кальцію на активність холінестерази.

Принцип методу. Холінестераза каталізує реакцію гідролізу нейромедіатора – ацетилхоліну з утворенням холіну та оцтової кислоти. В крові людини міститься два види холінестерази. В сироватці міститься неспецифічна псевдохолінестераза, яка розщеплює не лише ацетилхолін, але й інші ефіри холіну. В еритроцитах міститься специфічна, істинна ацетилхолінестераза, яка розщеплює лише ацетилхолін.

Фосфорорганічні сполуки (ФОС, фосфакол) є незворотними інгібіторами холінестерази та ацетилхолінестерази, оскільки ковалентно зв’язуються з активним центром ферменту і гальмують його активність. Препарати ФОС є високотоксичними отрутами для комах (пестициди) та теплокровних тварин. Механізм гальмівної дії полягає у зв’язуванні з ОН-групою серину в активному центрі ферменту.

Зростання концентрації іонів Са²⁺ в нервовому закінченні є безпосереднім біохімічним сигналом, що активує вихід ацетилхоліну через пресинаптичну мембрану, його взаємодію з холінорецепторамипостсинаптичної мембрани та розщеплення медіатора в синоптичній щілині ацетилхолінестеразою. Тому іони кальцію є потужним активатором холінестерази.

Метод кількісного визначення холінестерази ґрунтується на титруванні лугом оцтової кислоти, що вивільнилась в процесі гідролізу ацетилхоліну.

Кількість лугу, що пішла на титрування є мірою активності ферменту.

Хід роботи. Три пробірки заповнюють реактивами за таблицею.

Вміст пробірок	№ пробірки
	1	2	3
Сироватка крові, мл	0,5	0,5	0,5
Розчин CaCl2, крапель	---	5	---
Розчин фосфаколу, крапель	---	---	5
Інкубація при кімнатній температурі, 5 хвилин
Розчин ацетилхоліну –2%, мл	1,5	1,5	1,5
Інкубація 10 хвилин
Фенолфталеїн, крапель	2	2	2
Кількість 0,1М NaOH, що пішла на титрування

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

Клініко-діагностичне та практичне значення. Фізіологічно активні сполуки, що є інгібіторами ацетилхолінестерази, мають важливе фармакологічне та токсикологічне значення, оскільки спричиняють значне підвищення концентрації нейромедіатора як в структурах центральної нервової системи, так і в організмі в цілому.

Зворотні інгібіториацетилхолінестерази застосовуються в медицині з метою збільшення активності холінергічноїімпульсації, порушеної при певних неврологічних захворюваннях, таких як атонія кишечника, сечового міхура. Із зазначеною метою застосовуються препарати: Прозерин, Фізостигмін, Галантамін.

Незворотні інгібітори ацетилхолінестерази є потужними нервовими отрутами, які спричиняють різке збудження нервової системи із судомами, порушенням функції серцево-судинної, гастро-інтестинальної та інших фізіологічних систем організму. Найбільш поширеними незворотними інгібіторами є фосфорорганічні сполуки– ФОС. В сільському господарстві для боротьби зі шкідливими комахами використовують: хлорофос, дихлофос, метафос, карбофос, тощо. Нервово-паралітичними отрутами, що використовуються як бойові отруйні речовини є табун, зарин, зоман, тощо.

Висока чутливість холінестерази до дії фосфорорганічних сполук робить її специфічним біохімічним маркером для виявлення впливу цих отрут на організм людини.

Завдання 2. Дослідити вплив активаторів та інгібіторів на активність амілази слини.

Принцип методу. Сполуки, що підвищують активність ферментів, називаються активаторами, а сполуки, що знижують активність ферментів – інгібіторами. До активаторів відносяться іони багатьох металів, зокрема: Na⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Co²⁺ та ряд інших, а також органічні сполуки – проміжні продукти обміну речовин в організмі. Наприклад, жовчні кислоти є активатором ліпази, ацетил-КоА – активатором піруваткарбоксилази, тощо.

Інгібування ферментів поділяють на зворотне та незворотне. В свою чергу зворотне інгібування може бути конкурентним та неконкурентним.

Активатором амілази є хлорид натрію (NaCl), інгібітором – сульфат міді (CuSO₄). Показником впливу цих сполук на активність амілази є ступінь гідролізу крохмалю під дією ферменту в присутності NaCl та CuSO₄.

Хід роботи. Слину розводять в 2 рази. Беруть 3 пробірки. В пробірку №1 наливають 1мл води, в пробірку №2 – 0,8 мл води та 0,2мл 1% розчину NaCl, в пробірку № 3 – 0,8 мл води та 0,2мл 1% розчину CuSO₄. У всі три пробірки додають по 1мл слини. Вміст перемішують і додають по 2мл 1% розчину крохмалю, знову перемішують і ставлять в термостат чи на водяну баню при t=37°C на 15 хв.

Далі у всіх пробірках проводять реакцію з йодом. Спостерігають зміну забарвлення.

Результати роботи заносять у таблицю:

Вміст пробірок	№ пробірки
	1	2	3
Вода	1 мл	0,8 мл	0,8 мл
NaCl 1%	---	0,2 мл	---
CuSO4 1%	---	---	0,2 мл
Слина (розведення 1:2)	1 мл	1 мл	1мл
Крохмаль 1%	2 мл	2 мл	2 мл
Забарвлення після додавання йоду

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

Клініко-діагностичне та практичне значення. Інгібітори ферментів широко використовуються в медицині в якості лікарських засобів, зокрема ацетилсаліцилова кислота (аспірин)– інгібітор циклооксигенази (простагландин-синтази) використовується як протизапальний препарат, трисалол– інгібітор трипсину та контрикал– інгібітор протеїназ (зокрема калікреїнів) використовуються при панкреатиті, алопуринол – інгібітор ксантиноксидази застосовується при подагрі, тощо.

Ситуаційні задачі.