1.2.14. Унифицированный метод определения содержания общего белка по биуретовой реакции

Метод основан на том, что белки реагируют в щелочной среде с сернокислой медью с образованием соединения, окрашенного в фиолетовый цвет.

1. 154 ммоль/л хлорид натрия (изотонический раствор). Приготовление: 9,317 г NaCl довести до 1 л дистиллированной водой.

2. Биуретовый реактив. Приготовление: в мерную колбу на 1 л налить 100-150 мл дистиллированной воды, добавить 8 г NaOH, 45 г сегнетовой соли (калий-натрий виннокислый четырёхводный), 15 г сульфата меди (CuSO₄·5H₂O) и 5 г йодида калия (KI). Каждый компонент смеси добавлять после полного растворения предыдущего строго в указанной последовательности. Оставить стоять на ночь, затем довести водой до метки и профильтровать. Хранить в тёмной посуде в холодильнике.

3. 0,2 моль/л раствор гидроксида натрия: 8 г NaOH доводят водой до 1 л.

4. 30 ммоль/л раствор йодида калия: 0,5 г KI довести 0,2 моль/л NaOH до 100 мл.

5. Рабочий раствор биуретового реактива: к 20 мл биуретового реактива добавляют 80 мл 30 ммоль/л раствора KI.

6. Основной калибровочный раствор альбумина из человеческой сыворотки, 100 г/л: 1 г альбумина растворяют в 10 мл изотонического раствора хлорида натрия.

Ход определения. В две пробирки наливают по 5 мл биуретового реактива. В одну из пробирок добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки крови или гомогената сердца (опытная проба), в другую – 0,1 мл изотонического раствора NaCl (контрольная проба). Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Через 30 мин опытную пробу фотометрируют против контрольной при длине волны 540-560 нм (зелёный светофильтр) в кювете с длиной оптического пути 10 мм.

Расчёт ведут по калибровочному графику, для построения которого из калибровочного раствора альбумина готовят рабочие растворы с различной концентрацией белка (табл.4). Из каждого рабочего калибровочного раствора берут по 0,1 мл и вносят в пробирки, содержащие по 5 мл биуретового реактива. Через 30 мин все пробы фотометрируют против контрольной при 540-560 нм. по полученным данным строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс концентрацию белка в г/л, по оси ординат – величину экстинкции. Калибровочный график линеен до величины экстинкции 0,5. При более высокой величине экстинкции сыворотку разводят изотоническим раствором NaCl в соотношении 1:1.

Таблица 2

Приготовление рабочих калибровочных растворов белка

№ раствора	Основной калибровочный раствор альбумина,мл	Изотонический раствор NaCl, мл	Концентрация белка, г/л
1	0,4	0,6	40
2	0,6	0,4	60
3	0,8	0,2	80
4	1,0	-	100

Норма: 65-85 г/л. В мутной, гемолизированной сыворотке белок не определяют.

1.2.15. Определение содержания ά-токоферола

Метод основан на фотометрировании хромогенного комплексного соединения Fe²⁺, образующегося при взаимодействии α-токоферола с FeCl₃, и ортофенантролина [Бузлама В.С., 1997]. К 1 мл субклеточной фракции прибавляли 1 мл 96% этанола, тщательно перемешивали стеклянной палочкой и прибавляли 3 мл гексана, после чего встряхивали в течении 2 мин и центрифугировали 10 мин при 3000g. Из образовавшегося верхнего слоя отбирали 2 мл и переносили в 4 пробирки по 0,5 мл в каждую, после чего инкубировали на водяной бане при 50°С. Полученный сухой осадок растворяли в 1 мл бензола, добавляли 1 мл 0,025% спиртового раствора FeCl₃ и выдерживали в течение 5 мин при 25°С. В образовавшуюся смесь вносили 1 мл 0,05% спиртового раствора ортофенантролина и ровно через 2 мин измеряли оптическую плотность при длине волны 510 нм против пробы, содержащей 1 мл бензола и 2 мл этанола. Контрольная проба содержала 1 мл бензола, 1 мл 0,025% раствора FeCl₃ и 1 мл 0,05% раствора ортофенантролина. Из оптической плотности опытной пробы вычитали оптическую плотность контрольной пробы. Количество α-токоферола, участвующего в реакции с FeCl₃, определяли по калибровочной кривой.