1.2.1. Создание модели экспериментального ревматоидного артрита в тканях у экспериментальных животных

Для индуцирования экспериментального ревматоидного артрита группе (n=12) животных вводили 100 мкл полного адъюванта Фрейнда в подушечку лапки животного. Инъекции осуществляли один раз в день.

1.2.2.Подготовка материала для исследования

Сердце извлекали у животных под наркозом после многократного промывания ледяным физиологическим раствором. Промытое сердце осушали фильтрованной бумагой и тщательно измельчали ножницами. Измельченную ткань взвешивали на торсионных весах и гомогенизировали в фарфоровой ступке в 3х-кратном объеме охлаждённой среды выделения.

Полученную в результате гомогенизации вытяжку фильтровали через слой капрона с квадратными ячейками (0,1 мм) и центрифугировали при 3500g в течение 10 минут для отделения неразрушенных тканевых элементов и мембран кардиомиоцитов. Супернатант использовали для определения исследуемых параметров.

Венозную кровь набирали в чистую стеклянную пробирку без антикоагулянта и помещали на 0,5 часа в термостат при температуре 37 ⁰С, после расслаивания фаз собирали супернатант и центрифугировали его при 4000g в течение 10 мин. Полученную сыворотку использовали для дальнейшего исследования.

1.2.3.Определение интенсивности биохемилюминесценции

Для определения интенсивности процессов СО применяли метод железоиндуцированной хемилюминесценции, основанный на том, что в представленной схеме происходит каталитическое разложение пероксида водорода ионами металла с переходной валентностью – Fe²⁺, по реакции Фентона: Н₂О₂ + Fe²⁺ → ОН^– + ОН^●+ Fe³⁺. Образующиеся при этом свободные радикалы (R^●, OH^●, RO^●, RO₂^●, O₂^●) вступают в процесс инициации СО в исследуемом биологическом субстрате. Рекомбинация радикалов RO₂^● приводит к образованию неустойчивого тетроксида, распадающегося с выделением кванта света. Интенсивность свободнорадикальных процессов определяли на биохемилюминометре БХЛ-06 с программным обеспечением. Кинетическую кривую биохемилюминесценции регистрировали в течении 30 секунд (времени наибольшей информации об его интенсивности) и определяли следующие параметры: светосумму хемилюминесценции (S), интенсивность вспышки (I_max), характеризующие интенсивность свободнорадикальных процессов и величину тангенса угла наклона кривой (tg₂), характеризующую общую антиоксидантную активность. На интенсивность исследуемого процесса оказывает влияние полный комплекс соединений, обладающих как антиоксидантными, так и прооксидантными действиями, то есть метод дает возможность оценить уровень компенсаторных механизмов свободнорадикального процесса в организме. Данный метод является высокочувствительным на наличие патологических процессов в организме.

Среда для определения интенсивности биохемилюминесценции имела следующий состав: 0,4 мл 0,1М калий-фосфатного буфера (pH 7,5), 0,4 мл 0,01мМ FeSO₄, 0,2 мл 2%-ного раствора H₂O₂ (вносимого непосредственно перед измерением). Исследуемый образец сыворотки крови вносили в количестве 0,1 мл перед добавлением 2%-ного раствора H₂O₂.

1.2.4. Приготовление буферных растворов

Таблица 1.

Приготовление среды выделения

50 мМ трис-HCl буфер	1 мМ ЭДТА	2 мМ БМКЭ
15 мл	4,4 мг	2,4 мкл
30 мл	8,6 мг	5 мкл
70 мл	20,44 мг	10 мкл
100 мл	29,2 мг	14,3 мкл

Таблица 2.

Приготовление Калий-фосфатного буфера

0,1 М pH=7,4	50 мМ pH=7,4	0,3 М pH=8,0
653,6 мг KH2PO4 развести в 19 мл воды 3,693 г K2HPO4 развести в 81 мл воды	326,8 мг KH2PO4 развести в 19 мл воды 1,847 г K2HPO4 развести в 81 мл воды	546,6 мг KH2PO4 развести в 5 мл воды 12,995 г K2HPO4 развести в 95 мл воды
Добавляем меньший объем к большему пока pH не станет соответствующий. После этого доводим водой до 200 мл.
	653,6 мг KH2PO4 развести в 38 мл воды 3,694 г K2HPO4 развести в 162 мл воды. На 400мл мл.
	81,7 мг KH2PO4 развести в 4,75 мл воды 462 мг K2HPO4 развести в 20,25 мл воды

Приготовление Трис-HCl буфера pH=7,5 50 мМ для среды выделения

1. 2,42 г – Трис

2. Развести в 350 мл воды и довести кислотой pH до 7,5

3. Довести водой до 400 мл.

Приготовление Трис-HCl буфера pH=7,8 50мМ

1. 1,21 г – Трис

2. Развести в 180 мл воды

3. Довести кислотой pH до 7,8 и добавляем воды до 200 мл.

Приготовление среды элюции в Трис-HCl буфере pH=7,6-7,8

1. Трис – 0,5 г (на 450 мл), 130,5 мг – ЭДТА, БМКЭ – 22,5 мкл

2. Трис – 0,45 г (на 400 мл),116 мг – ЭДТА, БМКЭ – 20 мкл.