1.2.10. Методика определения концентрации цитрата

Количество цитрата определяли по методу Нательсона. Метод основан на образовании из цитрата при помощи бромного реактива и перманганата калия пентабромацетона, его экстракции петролейным эфиром и определения поглощения окрашенного комплекса с тиомочевинной при длине волны 430 нм. Расчёт производили по калибровочной кривой.

К 1 мл исследуемой жидкости прибавляли 0,8 мл 17%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Центрифугировали 5 минут при 4000g. В пробирку с притёртой пробкой к 0,5 мл надосадочной жидкости прибавляли 0,25 мл 50%-ного раствора H₂SO₄, 0,1 мл 1моль/л бромистого калия и 0,5 мл насыщенного раствора перманганата калия. Встряхивали и охлаждали в течение 20 минут в холодильнике. Избыток перманганата калия устраняли прибавлением по каплям 3%-ного раствора Н₂О₂. для экстрагирования образовавшегося пентобром ацетата добавляли петролейный эфир по частям: для начала 0,5 мл; потом 0,5 мл и ещё 0,3 мл. После добавления каждой порции петролейного эфира встряхивали в течение 5 минут при помощи шейкера. Для проведения цветной реакции 1 мл эфирного экстракта переносили в пробирку с притёртой пробкой, куда предварительно было внесено 2,5 мл 2%-ного раствора тиомочевины в боратном буфере. Пробирку встряхивали в течение 5 минут, после расслоения фаз окрашенный в светло-жёлтый цвет нижний слой осторожно отсасывали с помощью пипетки Пастера с оттянутым концом. Интенсивность окраски определяли на спектрофотометре СФ-56 при 430 нм. Фотометрирование проводили против контроля, для получения которого брали 0,5 мл 10%-ного раствора ТХУ и также обрабатывали.

1.2.11. Методика определения содержания цитратсинтазы

Необходимые реактивы:

1. 0,01 мМ ацетил-СоА: 1 мг на 500 мл воды

2. 0,25 мМ DTNB 1 мг на 10 мл 50 мМ трис-HCl pH 7,8

3. 0,2 мм оксалоацетат: 20 мг на 500 мл воды

Измерение:

контроль – 1 мл DTNB + 5 мл ацетил-СоА + оксалоацетат

опыт – 1 мл DTNB + 5 мл ацетил-СоА + оксалоацетат + 20 мл гомогената

λ=412 нм

1.2.12. Методика определения активности супероксиддисмутазы

Определение активности супероксиддиссмутазы проводили спектрофотометрически при длине волны =540 нм. Активность определяли по ингибированию скорости восстановления тетразолия нитросинего (НСТ) в неэнзимотической системе феназинметасульфата (ФМС) и НАДН.

Измерение активности СОД проводили в среде: 0,1 моль/л калий-фосфатный-буфер (рН 7,8); содержащий 0,33 ммоль/л ЭДТА; 0,41 ммоль/л НСТ; 0,01 ммоль/л ФМС; 0,8 ммоль/л НАДН. Субстрат добавляли из расчёта 0,03 мл на 1 мл среды инкубации. Реакцию запускали добавлением НАДН, регистрировали прирост оптической плотности в течение 5 минут.

За единицу активности СОД принимали количество фермента, необходимого для 50% ингибирования восстановления НСТ. Расчёт вели по формуле:

(2)

где E₀ и E_K - среднее значение прироста экстинции за 1 мин. (E/5 мин) соответственно в опытной и контрольной пробах.

1.2.13. Определение содержания белка по методу Лоури

Общий белок определяли по методу Лоури. Оптическую плотность растворов определяли на спектрофотометре при λ=750 нм. Метод основан на образовании комплексного окрашенного соединения в результате взаимодействия белка со щелочным раствором сульфата меди и вольфраматом и молибдатом натрия (реакция Фолина на тирозиновые и цистеиновые радикалы).

Количество белка рассчитывали по формуле:

Белок = (к×D×Vвыт.)/(Vвнес.×m),

где к – коэффицент пропорциональности, рассчитанный по калибровочной кривой;

D – оптическая плотность пробы;

Vвыт. – объем ферментной вытяжки,мл;

Vвнес. – объем вносимой пробы,мл;

m - масса навески мозга крысы.