1.2.7. Методика определения аконитатгидратазы

Aктивность AГ определяли спектрофотометрически при 233 нм. О скорости дегидратации цитрата в ходе АГ-реакции судили по возрастанию оптической плотности в результате образования двойной связи в молекуле цис-аконитата. Для oпределения активности АГ использовали среду следующего состава: 50 мМ трис-НCl-буфер, pН 7,8, содержащий 0,15 мМ цитрат. Реакцию начинали добавлением аликвоты ферментного препарата в спектрофотометрическую среду. Количество Е рассчитывали по формуле:

Е = ΔD•V_о•V₁/ε•t•V₂ , (1)

где ΔD – изменение оптической плотности пробы в единицу времени измерения t;

V_o - общий объём ферментного раствора, мл;

V₁ - объём реакционной среды, используемой для измерения активности фермента, мл;

V₂ - объём ферментного раствора, внесённый для измерения, мл;

ε - коэффициент молярной экстинкции для хромофорной группы субстрата, отражающий изменение оптической плотности при окислении или восстановлении 1 мМ субстрата в 1 мл среды (для цис-аконитата – 3,08);

t - время измерения активности фермента, мин.

1.2.8. Определение содержания диеновых конъюгатов

Содержание диеновых коньюгатов определяли спектрофотометрическим методом. Принцип метода состоит в том, что в ходе пероксидного окисления липидов на стадии образования свободных радикалов в молекулах полиненасыщенных жирных кислот возникает система сопряженных двойных связей, что сопровождается появлением максимума в спектре поглощения при 233 нм.

0,25 мл исследуемого материала растирали в течение 15 мин в гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма с 9 мл экстрагирующей смеси гептана с изопропиловым спиртом в соотношении 1:1. Полученную суспензию помещали в плотнозакрывающиеся полиэтиленовые пробирки. Пробы центрифугировали при 4000g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость переносили в градуированные пробирки и добавляли 1/10 объема дистиллированной воды. После двукратного встряхивания и расслаивания фаз отбирали гептановую фазу. К равным объемам по 0,5 мл приливали этиловый спирт в объемном отношении 1:5 – 1:10. В качестве контроля использовали 96% этанол.

Содержание диеновых конъюгатов в сыворотке крови рассчитывали по формуле:

[ДК] = ; мкМ/мл (5)

где [ДК] – концентрация диеновых конъюгатов;

V_общ – объём полученного образца, мл;

D – величина оптической плотности, ед.;

L – длина оптического пути, см;

E – коэффициент молярной экстинкции, равный 2,2*10⁵ М^-1с^-1;

V_внес – объём вносимой пробы, мл.

1.2.9. Определение активности каталазы

Определение активности каталазы проводили спектрофотометрически при длине волны =410 нм. Метод основан на способности пероксида водорода образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс с максимумом поглощения при =410 нм.

Необходимые реактивы: 0,08% раствор H₂О₂; 4,5% раствор аммония молибденовокислого; 0,1 моль/л трис-HCl-буфер, pH 7,4; буферно-субстратная смесь (10 мл трис-HCl-буфера pH 7,4+30 мл 0,08% H₂O₂₎

Таблица 1

Ход определения активности каталазы

	Контроль	Опыт	Примечание
Буферно-субстратная смесь	2 мл	2 мл	10 минут при 370С
Гомогенат	-	0,1 мл	3 минуты при 370С
Молибдат аммония	2 мл	2 мл	-
Гомогенат	0,1 мл	-	-

В качестве раствора сравнения использовали: 1 мл буфера, 3 мл H₂O и 0,1 мл гомогената.

Расчет результатов:

, (3)

где 4,1 – конечный объем пробы;

1,0×10⁴ фактор разведения;

10⁶ – коэффициент пересчета на мкм;

22,2×10⁶ – коэффициент молярной экстинции H₂O₂;

время инкубации, мин.