1.2.5. Определение активности ферментов

Активность выражали в ферментативных единицах или в виде удельной активности. За единицу ферментативной активности (Е) принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ продукта реакции за 1 мин при температуре 25°С. Активность ферментов определяли на спектрофотометре СФ-56 с программным обеспечением и на Hitachi. О скорости ферментативных реакций, сопряженных с окислительно-восстановительными превращениями НАД или НАДФ, судили по изменению оптической плотности при 340 нм. Расчет активности ферментов производили по следующей формуле:

Е = ΔD×Vк×V/ΔV×T×6,22 (5)

где D – прирост оптической плотности при 340 нм за определенное время;

1,0 – объем раствора в кювете, мл;

V – общий объем ферментного раствора, мл;

∆V – объем внесенной для измерения пробы, мл;

τ – время измерения, мин;

6,22 – коэффициент экстинкции для дегидрогеназ, соответствующий величине поглощения, которую дает 1 мкмоль кофермента, находящийся в 1 мл исследуемой смеси при измерении на спектрофотометре, когда толщина слоя измеряемого раствора 1 см.

1.2.5.1. Методика определения активности глутатионредуктазы

О скорости ГР-реакции судили по уменьшению оптической плотности опытных образцов при 340 нм в результате окисления НАДФН, протекающего за счет осуществления реакции восстановления глутатиона под действием ГР. Измерение активности ГР проводили в среде: 0,05 моль/л калий-фосфатный-буфер (рН 7,4), содержащий 1ммоль/л ЭДТА, 0,16 ммоль/л НАДФН, 0,8 ммоль/л окисленного глутатиона.

1.2.5.2. Методика определения активности глутатионпероксидазы

О скорости ГП-реакции судили по уменьшению оптической плотности опытных образцов при 340 нм в результате окисления НАДФН, протекающего за счет осуществления сопряженных ферментативных реакций: образования окисленного глутатиона под действием ГП и его последующего восстановления, взаимосвязанного с окислением НАДФН под действием ГР. Измерение активности ГП проводили в среде: 0,05 моль/л калий-фосфатный-буфер (рН 7,4), содержащий 1 ммоль/л ЭДТА, 0,12 ммоль/л НАДФН, 0,85 ммоль/л восстановленного глутатиона, 0,37 ммоль/л Н₂О₂., 1 ед/мл ГР. Контрольная проба не содержала восстановленный глутатион.

1.2.5.3. Методика определения никотинамидадениндинуклеотидфосфат-изоцитратдегидрогеназы

О скорости окислительного декарбоксилирования изоцитрата судили по возрастанию оптической плотности в результате восстановления НАДФ. Активность НАДФ-ИДГ определяли в среде следующего состава: 50 ммоль/л трис-HCl-буфер (рН 7,8), содержащий 1,5 ммоль/л изоцитрат, 2 ммоль/л MnCl₂, 0,4 ммоль/л НАДФ.

1.2.5.4. Методика определения глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

О скорости протекания глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакции судили по возрастанию оптической плотности опытных образцов при 340 нм в результате восстановления НАДФ в ходе катализируемого ферментом превращения глюкозо-6-фосфата в 6-фосфоглюконолактон. Среда спектрофотометрирования имела следующий состав: 0,05 моль/л трис-НСl-буфер (pH 7,8), содержащий 3,0 ммоль/л глюкозо-6-фосфат, 0,25 ммоль/л НАДФ, 1,0 ммоль/л МnCl₂. Реакцию начинали внесением ферментного препарата в среду.

1.2.6. Определение концентрации восстановленного глутатиона

Принцип метода:

Сульфгидрильная группа восстановленного глутатиона вступает в реакцию с 5,5 - дитио - бис - (2 - нитробензойной) кислотой (реактив Эллмана), в результате чего в эквимолярных количествах образуется окрашенный в желтый цвет тионитрофенильный анион (ТНФА), имеющий максимум поглощения при 412 нм [].

Ход определения восстановленного глутатиона:

В химическую пробирку наливали 0,5 мл супернатанта, 3,5 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера рН 7,4 и хорошо перемешивали. 2,0 мл разведенного в 8 раз супернатанта переносили в центрифужную пробирку и приливали к ней 1,0 мл 20% трихлоруксусной кислоты. Пробу тщательно перемешивали и оставляли в холодильнике на 15 - 20 минут. Пробы вынимали из холодильника и центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин при 0 ...+40⁰С. В химические пробирки наливали по 0,5 мл фосфатного буфера и в каждую добавляли по 1,0 мл надосадочной жидкости. В опытную пробирку № 1 приливали 0,05 мл реактива Эллмана, а в контрольную пробирку № 2 - 0,05 мл метанола. Содержимое пробирок хорошо перемешивали. Измеряли оптическую плотность опытной и контрольной проб против фосфатного буфера при λ=412 нм в 10 мм-вой кювете.

Расчет результатов:

Концентрация восстановленного глутатиона рассчитывается по формуле:

С = *72,6*10³, (6)

где С - содержание восстановленного глутатиона, ммоль/л;

13,1*103 - коэффициент молярной экстинкции ТНФА при 412 нм;

72,6 - фактор разведения.

Таблица 1

Этапы определения восстановленного глутатиона

Реактивы Пробы	Контроль	Опыт
0,3 моль/л калий-фосфатный-буфер (рН 8,0)	0,5мл	0,5мл
Надосадочная жидкость	1мл	1мл
Этанол	50 мкл	—
Реактив Эллмана	—	50 мкл