Отчёт (Большой практикум) Выращивание микроорганизмов Cupriavidus eutrophus с различными концентрации азота

Федеральное государственное автономное

образовательное учреждение высшего образования

«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Институт фундаментальной биологии и биотехнологии

Базовая кафедра биотехнологии

ОТЧЁТ ПО БОЛЬШОМУ ПРАКТИКУМУ

Выращивание микроорганизмов Cupriavidus eutrophus B-10646 с различными концентрации азота

Преподаватель: Жила Н.О.

Подпись, дата

Должность, ученая

Инициалы, фамилия

Студент: ББ16-34Б Широкова.К.

Номер группы, зачетной книжки

Подпись, дата

Инициалы, фамилия

Красноярск 2019

Методика:

Бактерии Cupriavidus eutrophus B-10646 выращивали в стеклянных колбах объемом 0,5л, заполненных культурой на 40% объема на термостатируемой качалке Innova 44 Incubator Shaker Series при температуре 30^оС. Для выращивания бактерий за основу была принята солевая среда Шлегеля следующего состава (г/л): Na₂HPO₄ ^. H₂O – 9,1; KH₂PO₄ – 1,5; MgSO₄ ^. H₂O – 0,2; Fe₃C₆H₅O₇ ^. 7H₂O – 0,25; NH₄Cl – 1,5 (превышение стандартной концентрации на 0.5); стандартный раствор микроэлементов по Хоагланду (из расчета 3 мл стандартного раствора на 1 л среды) стандартный раствор содержит: H₃BO₃ – 0,228; CoCe₂^6H₂O – 0,030; СuSO₄^ 5H₂O – 0,008; MnCe₂^4H₂O – 0,008; ZnSO₄^7H₂O – 0,176; NaMoO₄^2H₂O – 0,050; NiCe₂ – 0,008 (г/л)).

В качестве источника углерода использовалась фруктоза (20 г/л).

Оптическая плотность:

Периодически отбирали пробы культуры и измеряли оптическую плотность на фотоколориметре Unico при λ=440нм и длине оптического пути 1мм. Для этого делали разведение культуры с дистиллированной водой в соотношении 1:5.

Начальная оптическая плотность – 0,152 Конечная оптическая плотность – 0,473

*оптическую плотность измеряли без разведения

Биомасса:

Биомассу бактерий в культуре определяли весовым способом. Для этого 20 мл бактериальной суспензии центрифугировали 8 мин при 6000 g в центрифуге Ependorf 5810R. Затем дважды отмывали клетки от солей дистиллированной водой и снова центрифугировали. Отмытые клетки переносили в бюксы, предварительно доведенные до постоянного веса. Бюксы сушили при температуре 90^о С в сушильном шкафу в течение 24 ч, охлаждали в эксикаторе и взвешивали на весах Adventure Ohaus. Биомассу бактерий определяли, как разницу между весом бюкса с клетками и весом чистого бюкса.

Вес пустого бюкса – 19.2034 г. Вес бюкса с биомассой – 19.2935 г. Биомасса в культуре – 4.5 г/л.

Определение концентрации фруктозы:

Концентрацию фруктозы определяли резорциновым методом. Для этого супернатант разводили в 25 раз. Из разведения 1 мл пробы наливали в пробирку, куда добавляли: 1 мл спиртового раствора резорцина (1 г резорцина растворяли в 100 мл 95%-го этилового спирта); 3 мл 80%-го раствора соляной кислоты. В качестве контроля брали: 1 мл дистиллированной воды, 1 мл спиртового раствора резорцина, 3 мл 30%-го раствора соляной кислоты. Пробирки с контролем и пробой помещали на водяную баню на 20 мин., при t=80^oC. По истечении этого времени пробирки охлаждали до комнатной температуры и измеряли оптическую плотность на фотоколориметре Unico при λ=540 нм (длина оптического пути 5 мм).

Начальная концентрация фруктозы – 20 г/л. Конечная концентрация фруктозы – 7.58 г/л.

Определение содержания аммонийного азота:

Для определения содержания аммонийного азота к 10 мл дистиллированной воды добавляли 1 мл фугата, каплю щелочи (33%-го раствора КОН) и 0,5 мл реактива Несслера. В результате полученный раствор изменял свой цвет в зависимости от содержания азота. Окраску сравнивали со стандартом.

Начальная концентрация азота – 1.5 г/л. Конечная концентрация азота – 0.2 г/л.

Определение содержание в клетках ПГА:

Внутриклеточную концентрацию и состав ПГА определяли хроматографией метиловых эфиров жирных кислот после предварительного метанолиза образцов (навеска 3,9-4,5 мг) на хромато-масс-спектрометре GCD plus (“Hewlett Packard”, USA). Метанолиз проб полимера проводили следующим образом: к навеске сухой биомассы (3,9-4,5 мг) добавляли 1 мл внутреннего стандарта (0,5 мг бензойной кислоты/1 мл хлороформа), 0,85 мл метанола и 0,15 мл концентрированной серной кислоты и кипятили с обратными холодильниками в течение 2 часов 40 минут. По окончании метанолиза в колбу добавляли 1 мл дистиллированной воды.

Данные с хроматографа: Пик 1: 16673186 Пик 2: 56964786 Навеска: 4.5 мг Процентное содержание полимера в биомассе: 29.26%

Расчётные данные:

Удельная скорость роста по биомассе: ln (4.5) – ln (0.1) / 24 = 0.1585 Удельная скорость роста по фруктозе: ln (20) – ln (7.58) / 24 = 0.0404 Удельная скорость роста по азоту: ln (1.5) – ln (0.2) / 24 = 0.0839 Экономический коэффициент по фруктозе: (4.5 – 0.1) / (20 – 7.58) = 0.35 Концентрация полимера г/л: 4.5 * 0. 2926 = 1.305 г/л

Графики:

Вывод: Наиболее оптимальной концентрацией NH4CL для роста культуры является концентраций 1 г/л, при этой концентрации наблюдается наибольшая скорость роста, накопление биомассы и полимера в клетках микроорганизмов.