Сигнальные пути, участвующие в развитии пояса передних конечностей

Традиционно считалось, что пояса конечностей развиваются из того же морфогенетического поля, из которого формируется свободная конечность (Harrison, 1918). Эта точка зрения подтверждалась экспериментами в которых обработывали факторами FGF (Cohnуе et al., 1995; Crossley et al., 1996) боковую стенку мезодермы куриных эмбрионов, что приводило к развитию эктопической конечности вместе с поясом. К такому же результату приводили эксперименты с применением ретиноевой кислоты, которой обрабатывали регенерирующие конечности амфибий (Maden, 1983) или интактные конечности ранних эмбрионов грызунов (Rutledge et al., 1994).

Однако появились факты, которые поколебали традиционную теорию развития поясов конечностей. Выяснилось, что нарушения в структурах, необходимых для нормального развити свободных конечностей (апикальный эктодермальный гребень, зона поляризующей активности) приводили к недоразвитию дистальных отделов конечностей, но в поясах конечностей нарушений обнаружено не было. Такие результаты были получены в экспериментах по удалению апикального эктодермального гребня (Saunders, 1948), и у мутантов limbless (Prahlad et al., 1979), у которых не развивался апикальный эктодермальный гребень, и не экспрессировался Shh в зоне поляризующей активности, также не было свободных конечностей, но пояса развивались нормально (Ros et al., 1996).

Таким образом можно сделать вывод, что лишь на самых ранних этапах развития конечности пояс и свободная конечность закладываются единым морфогенетическим полем, тогда как вскоре после закладки пути развития этих двух компонентов расходятся. В связи с этим сейчас интенсивно исследуются сигнальные пути, участвующие в развитии поясов конечностей и экспрессия генов, вовлечённых в эти сигнальные пути.

Гены, определяющие способность клеток дермамиотомов формировать лопатку

Классические эксперименты по пересадке грудных сомитов куринного эмбриона в шею (Kieny et al., 1972; Jacob et al., 1975), в результате которых в шее развивались рёбра, показали, что сомиты содержат позиционную информацию, определяющую то, какие структуры из них сформируются. Пересадка же шейных сомитов в грудной отдел приводила к тому, что в месте трансплантации рёбра и лопатка не развивались. В 2004 году было показано, что пересаженные в шею из грудного отдела дермамиотомы способны сформировать лопатку (Ehehalt et al., 2004).

Таким образом грудные сомиты компетентны к воспринятию внешних факторов и формированию пластинки лопатки.

В первую очередь специфичность грудных сомитов определяется Hox генами, которые в них экспрессируются. Нокауты генов из групп HoxA и HoxD, которые ответственны за спецификацию свободной конечности вдоль проксимо – дистальной оси, приводили к нарушениям в свободной конечности, но не в поясе (Duboule, 1992, Rijli and Chambon, 1997, Zakany and Duboule, 1999). Ген Hoxc6 является передним меркером грудных сомитов (Sharpe et al., 1988) и возможно вовлечён в развитие пояса передних конечностей, так как экспрессируется районе коракоидного отростка и гленоидной ямки (Pellegrini et al., 2001). Подтверждением участия Hoxc6 в развитии лопатки может быть тот факт, что при локальной обработке ретиноевой кислотой проксимальной части почки передней конечности, область экспресии Hoxc6 расширяется, и это приводит к нарушению в лопатке – дупликации коракоидных отростков (Oliver et al., 1990). Также к нарушения в лопатке наблюдались у гомозиготных мутантов по гену Hoxb5, который, таким образом тоже может быть участником в развитии лопатки (Rancourt et al., 1995).

Эксперименты, в которых производили переворачивание сомита, который ещё не дифференцировался на склеротом и дермамиотом, вверх ногами или подсаживали на вентральную часть сомита ещё одну вентральную часть такого же сомита вместо дорсальной, развивалась нормальная лопатка. Это говорит о том, что в 17-24 сомитах, заложена информация о том, что они сформируют пластинку лопатки, однако то, какие клетки сомита будут участвовать в этом определяется под действием факторов из других зародышевых структур (Fomenou et al., 2005). Было показано, что удаление эктодермы над лопаточной областью приводит к нарушению в развитии пластинки лопатки (Ehehalt et al., 2004). При этом не происходит экспрессии Pax1 – раннего маркера клеток, входящих в состав пластинки лопатки. Известно, что фактор Wnt, вызывает экспрессию миогенных факторов Pax3 и Pax7 (Otto et al.,2006). Также эксксперименты, в которых проводили усиление Wnt сигналлинга с помощью металлопротеазы CPZ показали, что грудные дермамиотомы, в район которых ввели эктопически металлопротеазу CPZ экспрессируют Pax3, но активность Pax1 в этих не проявляется (Moeller et al.2003). Wnt экспрессируется промежуточной мезодермой (Kawakami et al., 2001) и эктодермой (Otto et al., 2006). Возможно эктодерма на более позних этапах производит фактор, который блокирует Wnt, например Frizzby, что приводит к тому, что клетки сомита перестают экспрессировать Pax3, и Pax7 и начинают экспрессировать Pax1. Эту гипотезу подтверждают эксперименты, в которых проводили блокирование экспрессии Pax3 и Pax7 в клетках дермамиотомов грудного отдела. Это приводило к тому, что клетки или погибали или начинали экспессировать Pax1 (Huang, Christ, Patel, 2006). Выдвигается также гипотеза, что Wnt не даёт дермамиотому деэпителизоваться, и что Pax1 может экспрессироваться только в мезенхиме, таким образом эктодермальный фактор, вызывающий блокирование Wnt, способствует эпителиально – мезенхимному переходу, необходимому для экспрессии фактора Pax1 клетками грудных дермамиотомов (Ehehalt et al., 2004). Также было отмечено, что для развития лопатки необходимы сигналы и из других структур. Проводились эксперименты, в которых сомиты изолировались от осевых структур, с помощью имплантации между ними металлической пластинки. Эта изоляция не приводила к нарушениям в лопатке. Также удаление осевых структур и мутации по гену Shh не приводили к нарушениям в лопатке, что говорит о том, что осевые структуры не оказывают влияния на этот элемент пояса передних конечностей. Однако барьер между мезодермой боковой пластинки и сомитами вызвал недоразвитие лопатки (Wang et al., 2005). При этом также как и в случае с барьером между эктодермой и сомитом была нарушена экспрессия Pax1. Когда к сомитам в этой же работе подсаживали клетки, экспрессирующие Noggin – блокатор факторов BMP, экспрессия Pax1 также была подавлена, и лопатка не развивалась. Скорее всего при этом события развивались следующим образом. Известно, что BMP является активатором, поддерживающим экспрессию Pax7 в дермамиотомах (Hoffman et al., 1998) и соответственно развитие дермамиотома. Так как клетки лопатки происходят из дермамиотома, при инактивации BMP, он перестаёт поддерживать Pax7, и дермамиотом не развивается. Таким образом не удивительно, что клетки лопатки не образуются, и Pax1 не экспрессируется в почке конечности

В работе, в которой исследовали экспрессию факторов BMP в почке конечности и взаимоотношения этих факторов с экспрессией Pax1 (Hofmann et al.,1998) показано, что паттерны экспрессии этих факторов не перекрывается, и видимо BMP4 ограничивает экспрессию Pax1 в дистальном направлении. Если внести BMP2 или BMP4 эктопически в район экспрессии Pax1 то эта экспрессия будет подавлена, и в развитии лопатки появятся серьёзные дефекты. Помимо подавления экспрессии фактора Pax1 факторы BMP блокируют и экспрессию фактора Pax3. Таким образом, можно сделать вывод, факторы BMP активируют экспрессию гена Pax1 не напрямую, а запускают какой-то промежуточный фактор или цепочку факторов, которые уже в свою очередь и включают экспрессию Pax1

Экспрессия гена Pax1 происходит в клетках склеротома, которые участвуют в формировании позвоночника и в клетках дермамиотома, которые в идут по пути формирования хряща пластинки лопатки. Экспрессия Pax1 в месте будущей лопатки начнается незадолго до формирования хряща. Эта экспрессия осуществляется клетками субэктодермальной мезенхимы проксимальной части почки конечности, мигрировавшими из гипаксиальной губы дермамиотома (Huang et al., 2000). До перехода в мезенхимное состояние, в клетках гипаксиальной губы дермамиотома экспрессия Pax1 не наблюдается.

У мышиных мутантов undulated с мутантным геном Pax1 наблюдается недоразвитие лопатки и позвоночника (Wallin et al.,1994). Гомозиготные мышиные мутанты по Pax1 характеризуются отсутствием акромиона и части лопаточного гребня. (Wilm et al., 1998).

Для развития лопатки важен также фактор Emx2. У мышиных зародышей Emx2 в области почек конечностей экспрессируется в проксимальных частях этих структур. Этот фактор у мышей работает также в развивающихся почках и головном мозге, поэтому нуль-мутанты по гену Emx2 умирают сразу после рождения. Было отмечено, что у гомозиготных мышиных мутантов по этому гену не развивается лопатка и подвздошная кость, причём от лопатки остаются только дистальный конец акромиона, который соединяется с ключицей, и коракоидный отросток, сочленяющийся с головкой плеча (Pellegrini et al., 2001). Исследуя у мышей экспрессию разных факторов с помощью иммуногистохимии, Пеллегрини с коллегами пришли к следующим выводам: Emx2 экспрессируется во всей пластинке лопатки и большей части акромиона, а также вместе с Pax1 экспрессируется в гребне лопатки. Домен экспресси Pax1 в лопатке отмечен также в дистальном конце акромиона.

Исследование экспрессии Emx2 было проведено и у куриц (Prols et al., 2004). У куринного эмбриона домен экспрессии Emx2 в почке передней конечности находится в проксимальной части почки и на её заднем крае. Создание оверэкспрессии Emx2 в почке конечности не приводило к дефектам в поясе, но зато появлялся эктопический задний палец на передней стороне аутоподия, что говорит о том, что Emx2 является фактором, работающим в становлении не только проксимо – дистальной оси конечности, но и передне-задней. При удалении апикального эктодермального гребня нарушений в характере экспрессии Emx2 не происходило. В скелете пояса передних конечностей при этом наблюдался небольшой дефект в месте сочленения головки лопатки и прокоракоида. Эктопическое же внесение фактора Fgf8 в проксимальную часть почки конечности приводило к снижению уровня экспрессии Emx2 и эктопической экспрессии Fgf10. Внесение ретиноевой кислоты в почку конечности приводило наоборот к увеличению экспрессии Emx2. Удаление эктодермы, располагющейся над грудными сомитами на стадии 14-15 по Гамбургеру и Гамильтону (2 суток развития) приводило к тому, что пластинка лопатки не формировалась, но экспрессия Emx2 в проксимальной части почки конечности была нормальной. Таким образом был сделан вывод, что экспрессия Emx2 для развития лопатки необходима, но не является достаточной – необходим ещё какой-то фактор из эктодермы. Репрессия ретиноевой кислоты с помощью специфического ингибитора AGN приводила также к неразвитию пластинки лопатки.

Репрессия рецептора FgfR1 (рецептор к фактору Fgf10) с помощью специфического ингибитора SU-5402 приводила к отсутствию головки лопатки. Когда проводили и удаленение эктодермы над грудными сомитами и внесение SU-5402, лопатка не развивалась вообще, как и свободная конечность.

В результате был сделан вывод, что в проксимальной части почки конечности ретиноевая кислота активирует экспрессию Emx2, определяющий проксимальную специфичность конечности и ингибирует экспрессию Fgf10 и Fgf8. В дистальных частях конечности активны факторы Fgf8, который ингибирует экспрессию Emx2, что придаёт этой части конечности дистальную специфичность и усиливает экспрессию Fgf10, который активирует рецептор FgfR1, необходимый для развития пластинки лопатки.

Было также показано, что в развитии плечевого пояса участвуют гены Alx4, Tbx15, Cart1 и Gli3 (Kuijper et al., 2005). Получая мышиных мутантов по этим генам с помощью их нокаутирования было показано, что разные участки лопатки и ключицы зависят от экспрессии этих транскрипционных факторов. Так, развитие передней части лопатки (fossa supraspinatous) зависит от экспрессии Alx4 и Cart1, развитие задней части лопатки (fossa infraspinatous) зависит от экспрессии фактора Gli3. Гребень лопатки развивается нормально в присутствии фактора Tbx15, развитие проксимальной части акромиона требует экспрессии Pax1, а ключица развивается в присутствии сразу трёх факторов: Alx4, Cart1 и Tbx15.