Сайт-специфічна рекомбінація

Як приклад сайт-специфічної рекомбінації розглянемо інсерцію (інтеграцію) ДНК бактеріофага λ у бактеріальну хромосому (див. також розділ 5). У складі фагової ДНК є сайт attP – ділянка довжиною 270 пар основ, у складі бактеріальної ДНК – сайт attВ (23 пари основ (рис. 10.7). Обидва сайти мають ділянку спільної (або гомологічної) послідовності довжиною 15 пар основ. Два білка – бактеріальний IHF (Integration Host Factor) та продукт одного з генів бактеріофага інтеграза – зв'язуються з цими сайтами.

За механізмом своєї дії інтеграза є сайт-специфічною ДНК-топоізомеразою І (див. розділ 3). Чотири субодиниці білка містять чотири активних центри, в кожному з яких розташований залишок Tyr. На першому етапі інтеграції два активних центри роблять два одноланцюгових розрізи у бактеріальній та фаговій ДНК, одночасно ковалентно приєднуючи кінцеві фосфати до залишків Tyr. Далі відновлюється фосфодіефірний зв'язок, але з відповідним кінцем іншого дуплекса – відбувається обмін ланцюгами. На цьому етапі утворюється конфігурація чотирьох ланцюгів, що є еквівалентною до структури Холідея. Після цього друга пара субодиниць робить другу пару розривів (на відстані 7 пар основ від першого розриву у кожному ланцюзі), і здійснюється друга пара обмінів ланцюгами, що й призводить до інтеграції.

Рис. 10.7. Інтеграція ДНК бактеріофага λ у бактеріальний геном.

Рис. 10.8. Інверсія у бактеріофага μ.

Подібно до інтегрази працює інвертаза – сайт-специфічна топоізомераза І, яка здійснює інверсію ділянки ДНК бактеріофага μ. Ділянка довжиною 3000 пар основ, що піддається інверсії, містить на кінцях короткі інвертовані повтори (рис. 10.8). Чотири субодиниці інвертази здійснюють чотири тимчасових розрізи, відбувається обмін кінців та відновлення зв'язків, результатом чого є зміна напряму. Інвертована ділянка містить два гени, що перекриваються, на різних ланцюгах ДНК (тобто такі, що піддаються транскрипції у різних напрямах). У результаті інверсії той чи інший ген (у залежності від виду бактерії, в яку потрапив фаг) підставляється під промотор і транскрибується.

Розглянуті приклади вказують на основну різницю між двома типами рекомбінації: якщо при гомологічній рекомбінації дві молекули ДНК впізнають одна одну шляхом порівняння своїх послідовностей по великій довжині, сайт-специфічна рекомбінація передбачає наявність також гомологічних, але коротких елементів послідовності, що впізнаються специфічними білками.

Процеси сайт-специфічної рекомбінації за механізмами, цілком аналогічними до розглянутих, дуже поширені у бактеріофагів, при інсерції плазмід в основний геном у бактерій та дріжджів, вирізанні плазмід. Що стосується вищих еукаріотів, одним з головних процесів, в ході якого використовуються механізми сайт-специфічної рекомбінації, є созрівання імуноглобулінових генів (див. нижче).

Рис. 10.9. Незаконна рекомбінація двох циркулярних молекул ДНК.

Незаконна рекомбінація

Під незаконною рекомбінацією зазвичай розуміють об'єднання двох молекул ДНК без гомології послідовностей та без участі механізмів сайт-специфічної рекомбінації, коли з'єднання молекул відбувається у будь-якому місці послідовності.

Наприклад, повністю негомологічні молекули ДНК фага λ та плазміди pBR322 можуть об'єднатися за допомогою гірази (див. розділ 3). Дві молекули гірази (по 4 субодиниці у кожній) роблять тимчасовий дволанцюговий розріз у кожній з молекул ДНК (розірвані кінці утримуються гіразою). Після цього дві гірази обмінюються парами субодиниць і відновлюють фосфодіефірні зв'язки (рис. 10.9).

Більш загальним механізмом незаконної рекомбінації є репарація дволанцюгових розривів системою негомологічного з'єднання кінців (див. рис. 9.28), яка призводить до з'єднання чужорідних молекул ДНК. Механізми незаконної рекомбінації (поряд із такими сайт-специфічної) використовуються при дозріванні імуноглобулінових генів з метою підвищення їх розмаїття.