191 Розділ 10. Рекомбінація днк

Чекалинский снова стасовал карты: игра пошла

своим чередом.

А. Пушкин

"Пиковая дама"

Суттєвим моментом існування ДНК в живих системах є не тільки розглянуті у попередньому розділі процеси відновлення та збереження інформації, що міститься у послідовності нуклеотидів, а й різноманітні операції, спрямовані на перетасовку цієї інформації з метою створення нових комбінацій генів. Серед процесів рекомбінації (recombination), які призводять до генетичного розмаїття, розрізняють наступні.

• Гомологічна рекомбінація – обмін ділянками між досить довгими молекулами ДНК з гомологічними послідовностями пар основ. Відбувається в усіх організмів, що розмножуються статевим шляхом, між гомологічними хромосомами при мейозі (кросинговер), а також при мітозі та у прокаріотів – наприклад, після кон'югації двох бактеріальних клітин і проникнення ДНК з однієї в іншу.

• Сайт-специфічна рекомбінація – вирізання/вбудовування однієї молекули ДНК з/в іншу, або зміна орієнтації (інверсія) фрагмента ДНК у межах однієї молекули. відбувається за рахунок впізнання специфічними білками коротких елементів послідовності ДНК.

• Незаконна рекомбінація – об'єднання двох молекул ДНК, які не мають ані гомології, ані специфічних елементів послідовності.

• Переміщення в межах геному мобільних елементів послідовності ДНК.

Гомологічна рекомбінація

Рис. 10.1. Початкові стадії гомологічної рекомбінації.

Необхідною умовою для здійснення гомологічної рекомбінації є загальна гомологія між двома молекулами ДНК по всій довжині.

Загальну модель початкового етапу гомологічної рекомбінації представлено на рис. 10.1. Ініціюючою подією є дволанцюговий розріз в одній з гомологічних молекул. Цей розріз “розширюється“ шляхом 5'-екзонуклеазної деградації ДНК – у результаті у місці розрізу залишаються два одноланцюгові 3'-хвости. Один з них здійснює інвазію – утворює подвійну спіраль з антипаралельним ланцюгом інтактної гомологічної молекули ДНК. Інший ланцюг цієї останньої, відповідно, виштовхується з дуплексу у вигляді одноланцюгової D-петлі. D-петля (від displacement), разом з 3'-хвостом, здатна переміщуватись у пошуку гомології – максимальної комплементарності у межах подвійної спіралі, що утворилася між ланцюгами двох гомологічних молекул ДНК. На наступному кроці відбувається репараційний синтез ДНК: два 3'-кінця розірваної молекули ДНК подовжуються ДНК-полімеразами з використанням у якості матриць двох ланцюгів інтактної молекули. До цього моменту схема на рис. 10.1 є одночасно схемою точної репарації дволанцюгового розриву в одній з двох сестринських молекул ДНК під час реплікації.

Під час рекомбінації відновлення цілісності ДНК є тільки завершенням початкового етапу. У результаті інвазії та репараційного синтезу дві молекули ДНК об'єднуються у чотирьох-ланцюгову структуру з двома перехрещеннями ланцюгів – структурами Холідея (Robin Holliday). Кожна структура Холідея може переміщуватись (так звана міграція гілки), результатом чого є подовження гетеродуплекса – подвійної спіралі між двома майже комплементарними ланцюгами двох гомологічних молекул ДНК.

Рис. 10.2. Механізм початкових стадій гомологічної рекомбінації у E. coli.

Вважається, що за схемою на рис. 10.1 відбуваються початкові стадії гомологічної рекомбінації у більшості про- та еукаріотів. Але механізми цих процесів найкраще вивчені для бактерій. У E. coli два кінці розірваної молекули ДНК впізнаються комплексом трьох білків – recBCD (рис. 10.2), який має геліказну та екзонуклеазні активності. Комплекс починає рухатися, руйнуючи подвійну спіраль і одночасно деградуючи ДНК за рахунок своїх 5'- та 3'-екзонуклеазних активностей. У так званому χ-сайті (сайт підвищеної частоти рекомбінації у E. coli – послідовність довжиною 8 пар основ, що зустрічається із середньою періодичністю у 5000 пар основ) 3'-екзонуклеазна активність гальмується, результатом чого є утворення одноланцюгового 3'-кінцевого хвоста. Цей хвіст відразу вкривається білком recА. Білок recА має два сайти зв'язування з ДНК, за рахунок першого з них і відбувається (у присутності АТР як кофактора) кооперативна взаємодія з одноланцюговою ДНК: молекули білка оточують полінуклеотидний ланцюг, формуючи на його поверхні праву спіраль. Саме цей комплекс і здійснює інвазію у подвійну спіраль інтактної гомологічної молекули ДНК: другий сайт взаємодії recА з ДНК використовується на цій стадії для утворення комплексу, що містить два ланцюги гомологічних молекул ДНК. За умови комплементарності двох ланцюгів відбувається гідроліз АТР, після чого recА втрачає спорідненість до ДНК, залишаючи сформований гетеродуплекс.

Рис. 10.3. Ізомерізація структури Холідея.

Повертаючись до останньої панелі на рис. 10.1, розглянемо окрему структуру Холідея. Як показано на рис. 10.3, її можна піддати ізомерізації, повернувши два дволанцюгові кінці на 180°. Саме у формі без перехрещення ланцюгів (праворуч на рис. 10.3) структура Холідея фіксується завдяки її взаємодії з гомотетрамерним білком ruvA: білок зв'язується з центром хреста, утримуючи 4 одноланцюгові ділянки у приблизно планарній квадратній конфігурації (рис. 10.4, а). З ruvA та двома дуплексами, що виходять з хреста у протилежних напрямах, взаємодіє білок ruvВ (6 субодиниць, які оточують подвійну спіраль кільцем). RuvВ працює як АТР-залежна геліказа (або, скоріше, як комплекс ремоделювання хроматину, див. рис. 6.16): два гексамери ruvВ генерують обертальні рухи подвійної спіралі у протилежних напрямах, що призводить до протягування ланцюгів через комплекс ruvА/ruvВ (рис. 10.4, б). Саме активність ruvВ, таким чином, і призводить до переміщення структури Холідея – міграції гілки з одночасним подовженням гетеродуплекса.

Схема на рис. 10.5 пояснює, як можна ототожнити протягування чотирьох полінуклеотидних ланцюгів із міграцією гілки. На схемі у два етапи проведено формальну ізомеризацію планарної конфігурації структури Холідея у конфігурацію з перехрещенням: на першому етапі два ланцюги у складі хреста випрямляються, на другому – нижня частина отриманої конфігурації обертається на 180°. Очевидно, що зображене на рис. 10.4, 10.5 протягування ланцюгів через комплекс ruvA/ruvВ є еквівалентним до зсуву перехрещення у правий бік.

Рис. 10.4. (а): Комплекс ruvA зі структурою Холідея (1BDX, показано лише С^α-атоми білка та Р-атоми ДНК). (б): Схема переміщення структури Холідея за рахунок активності ruvB: стрілки вказують напрям обертання дуплексів та напрям руху ланцюгів через комплекс ruvA/ruvВ (колір стрілок співпадає з таким ланцюгів).

Рис. 10.5. Спрощена схема комплексу ruvВ зі структурою Холідея з рис. 10.4 та її формальні перетворення у дві топологічно еквівалентні конфігурації. Остання конфігурація співпадає з правою структурою Холідея з рис. 10.1. Кольорові стрілки вказують напрям руху ланцюгів через ruvВ, чорні – напрям руху дуплексів і перехрещення.

Останньою подією рекомбінації є розділення (resolution) структури Холідея резольвазою – білком ruvС. Резольваза є ендонуклеазою, дві молекули якої взаємодіють з комплексом ruvА/ruvВ і двома ланцюгами хреста, розташованими один проти одного: є два рівноймовірні варіанти такого зв'язування. Отже, резольваза робить дволанцюговий розріз через хрест двома можливими шляхами (рис. 10.6). Після наступного зашивання розривів лігазою залишаються дві дволанцюгові молекули ДНК.

На рис. 10.6 представлено ізомеризовану чотирьох-ланцюгову структуру з рис. 10.1 – дві структури Холідея з перехрещеннями перетворені на планарні (ділянки, що синтезовані шляхом репарації, не позначено) – та результат її розділення. З чотирьох можливих комбінацій розділення двох структур Холідея показано дві. Одна з цих комбінацій призводить до рекомбінації (аналогічно, рекомбінантною є і пара розрізів 2+4): дві гомологічні молекули ДНК обмінялися ділянками, і умовна “абетка“, якою позначено фрагменти ДНК, змінює регістр – великі літери замінюються на маленькі та навпаки. Пари розрізів 1+4 та 2+3 не призводять до рекомбінації. Таким чином, рекомбінація при розділенні структур Холідея відбувається з імовірністю 50%.

Як можна бачити, незалежно від того, чи відбулася рекомбінація, усі продукти містять гетеродуплекси (середня частина усіх кінцевих молекул на рис. 10.6). Оскільки

Рис. 10.6. Схема розділення двох структур Холідея. Конфігурація чотирьох ланцюгів зверху є еквівалентною до конфігурації на нижній панелі рис. 10.1. Літерами позначено ділянки ланцюгів (великі та маленькі літери відповідають гомологічним ділянкам двох молекул, літери зі штрихом та без – комплементарним ділянкам вихідних дуплексів). Цифрами 1–4 позначено можливі розрізи резольвазою. Внизу: дві пари дволанцюгових молекул після розділення структур Холідея, отримані у результаті відповідних розрізів.

гетеродуплекси складаються з майже комплементарних ланцюгів, вони містять місметчі. Відповідно, кінцевою операцією, яка завершує процес гомологічної рекомбінації, є репарація цих місметчів описаною у попередньому розділі системою mutHLSU. На відміну від того, як ця система спрацьовує після реплікації, після рекомбінації ланцюг, де відбувається заміна нуклеотидів, обирається випадково. Тобто, наприклад, центральний фрагмент першої молекули на рис. 10.6 перетворюється або на В/В', або на b/b'. Якщо на цій ділянці розташований ген, шляхом репарації обирається один з його алелів – В чи b. Отже, побічним ефектом рекомбінації є відоме в генетиці явище конверсії гена. Білки системи mutHLSU якимось чином блокують рекомбінацію на ранніх етапах, коли місметчів виявляється надто багато (так звана гомеологічна рекомбінація): міграція гілки зупиняється, і чужорідна ДНК виштовхується з гетеродуплекса.

Еукаріотичні клітини містять білки, що є гомологічними до бактеріальних білків RecA, RecBCD, RuvA, B та C. Наприклад, білок RAD51 дріжджів та людини є гомологічним до білка RecA і виконує подібні функції. Ініціюючий рекомбінацію дволанцюговий розріз індукується у дріжджів білком Spo11, що належить до родини ДНК-топоізомераз ІІ. Гомологічні білки знайдені у інших еукаріотів та бактерій. Отже, механізми гомологічної рекомбінації є, імовірно, спільними для усіх біологічних систем.