Сплайсинг

Рис. 7.3. Узагальнена схема послідовності нуклеотидів інтрона.

Узагальнену схему інтрона представлено на рис. 7.3. На кінцях переважної більшості інтронів розташовані стандартні динуклеотиди GU та AG, що знаходяться у складі певних консенсусних послідовностей. Ближче до 3'-кінця, перед піримидин-збагаченим треком довжиною ~15 нуклеотидів знаходиться ще один консенсус, до складу якого обов'язково входить аденіновий нуклеотид. Цей А є так званою точкою розгалуження (branch point), яка виконує особливу роль.

Сплайсинг інтрона полягає у послідовності двох хімічних реакцій трансестерифікації (заміни одного фосфодіефірного зв'язку на інший), які показано на рис. 7.4.

Рис. 7.4. Дві стадії сплайсингу.

1. Аденіновий нуклеотид у точці розгалуження має підвищену реакційну здатність (унаслідок особливостей просторової структури інтрона, див. нижче). 2'-ОН група його рибози здійснює нуклеофільну атаку фосфату в 5'-сплайс сайті – на границі між лівим екзоном та інтроном. У результаті зв'язок між цим фосфатом та 3'-кінцевим нуклеотидом екзона замінюється на зв'язок між фосфатом та 2'-ОН групою аденінового нуклеотиду – у 5'-кінцевій частині інтрона утворюється так зване ласо (lariat).

2. ОН-група, що залишилася на 3'-кінці першого екзона атакує фосфодіефірний зв'язок у 3'-сплайс сайті. Цей зв'язок розривається, замінюючись на зв'язок між двома екзонами.

Оскільки число фосфодіефірних зв'язків не змінюється, реакція трансестерифікації є ізоенергетичною і не потребує АТР як джерела енергії. Але звичайно, обидві реакції сплайсингу потребують каталізу, і, на відміну від інших реакцій, що розглядалися досі, каталізаторами сплайсингу не виступають білкові ферменти.

Сплайсосома: механізм сплайсингу

Обидві реакції сплайсингу здійснюються у складі спеціальної мультимолекулярної структури – сплайсосоми (spliceosome), яка зв'язана з CTD і утворюється на кожному інтроні за участю самої пре-мРНК, білків та особливих молекул так званих маленьких ядерних РНК (small nuclear RNA, snRNA).

Рис. 7.5. Схема структури маленької ядерної РНК U2 у комплексі з зоною розгалуження інтрона.

Маленькі ядерні РНК, які синтезуються РНК-полімеразою ІІ на відповідних генах, що згруповані у кластери, відіграють ключову роль у визначенні просторової структури, формуванні та функціонуванні сплайсосоми. У сплайсингу приймають участь п'ять типів маленьких ядерних РНК (довжиною 100-200 нуклеотидів): U1, U2, U4, U5 та U6.

Маленькі ядерні РНК, які знаходяться у клітині у вигляді комплексів зі специфічними білками, мають певну просторову структуру за рахунок утворення комплементарних подвійних спіралей – шпильок. Завдяки комплементарного спарювання з консенсусними послідовностями інтрона відбувається їх взаємодія з пре-мРНК та іншими маленькими ядерними РНК. Наприклад, РНК U2 впізнає консенсус у зоні розгалуження, причому згаданий вище аденіновий нуклеотид залишається неспареним – “випетлюється“ між сусідніми парами основ (рис. 7.5). Саме ця обставина визначає його особливий конформаційно-напружений стан і, як наслідок, підвищену реакційну здатність.

Оскільки подвійні спіралі РНК у сплайсосомі є короткими, вони потребують додаткової стабілізації. Крім того, під час збірки та функціонування сплайсосоми певні спіралі мають бути зруйновані та замінені на інші. Обидві операції забезпечуються білками сплайсосоми. Отже, роль білків сплайсосоми зводиться до наступного:

• розкручування подвійних спіралей РНК АТР-залежними геліказами;

• стабілізація подвійних спіралей та загальної просторової структури сплайсосоми білками зі специфічною спорідненістю до РНК;

• регуляція сплайсингу – блокування чи підсилення ефективності збірки сплайсосоми на даному інтроні білками-регуляторами сплайсингу (SR, Splicing Regulators).

Загальний сценарій збірки та роботи сплайсосоми схематично зображено на рис. 7.6. Після синтезу 5'-кінцевої зони інтрона, вона впізнається маленькою ядерною РНК U1 за рахунок комплементарного спарювання між U1 та 5'-сплайс сайтом (U1 при цьому зв'язана з відповідними білками). Далі по мірі синтезу пре-мРНК зона розгалуження впізнається специфічним білком ВВР (Branch point Binding Protein, позначається також як SF1 у ссавців). 3'-Кінцева зона інтрона та Y-збагачений трек впізнаються допоміжним білком U2АF (U2 Auxiliary Factor), який далі сприяє заміні ВВР на РНК U2. Зв'язування U2 (яке, власне, визначає точку розгалуження, див. рис. 7.5) потребує АТР-залежного руйнування певних подвійних спіралей у складі цієї молекули. На наступних стадіях збірки та перебудов сплайсосоми (рис. 7.6) також відбувається АТР-залежне руйнування частини подвійних спіралей та заміна їх іншими.

Після зв'язування U2, на завершальному етапі збірки, з інтроном взаємодіє потрійний комплекс U4-U5-U6: U4 при цьому звільнюється, а U6 витісняє U1, взаємодіючи з 5'-кінцевою зоною інтрона. Крім того, U6 взаємодіє з U2, сприяючи наближенню 5'-сплайс сайта до точки розгалуження. Додатково структура стабілізується маленькою ядерною РНК U5, що взаємодіє з 3'-кінцем першого екзона та іншими елементами сплайсосоми.

Рис. 7.6. Схема збірки сплайсосоми та її функціонування.

Після формування сплайсосоми здійснюється її структурна перебудова (АТР-залежне розплітання частини подвійних спіралей геліказами), результатом якої є безпосереднє наближення 5'-сплайс сайта до точки розгалуження: виникають умови для першої реакції трансестерифікації з утворенням ласо (див. також рис. 7.4). Хімічна перебудова інтрона викликає нову перебудову просторової структури сплайсосоми: за рахунок одночасної взаємодії з U5 наближуються один до одного кінці екзонів, що створює умови для другої трансестерифікації. На останньому етапі від двох вже з'єднаних екзонів АТР-залежним шляхом (порушення комплементарних взаємодій) видаляється комплекс інтрона з маленькими ядерними РНК.

Таким чином, сплайсосома працює як АТР-залежна молекулярна машина. Структурні перебудови машини забезпечують перегрупування елементів – субстратів реакцій сплайсингу. Каталіз обох реакцій сплайсингу здійснюється молекулами РНК. Механізм каталізу є таким самим, як для білкових ферментів (див. розділ 2). Наприклад, для першої реакції активний центр формується зоною розгалуження інтрона та маленькими ядерними РНК U2 та U6. Просторова структура активного центра жорстко утримує субстрати – 5'-сплайс сайт та точку розгалуження – у певній взаємній орієнтації та забезпечує підвищену реакційну здатність аденінового нуклеотида, який можна розглядати одночасно і як субстрат у збудженому проміжному стані, і як компонент активного центра. У хлоропластах сплайсинг відбувається за механізмом так званого самосплайсинга (self-splicing) – без участі білків та маленьких РНК: мРНК сама набуває просторової структури, яка має каталітичну активність щодо сплайсинга.

За аналогією з білковими ензимами, молекули РНК, які мають каталітичну активність, називають рибозимами. Одним з таких рибозимів є сплайсосома. Як правило, каталітична активність рибозима (як і у випадку сплайсосоми) залежить від білків, які виконують допоміжні функції, стабілізуючи структуру активного центра. Можливо, на ранніх етапах добіологічної еволюції головними (або єдиними) біологічними макромолекулами були молекули РНК (так званий РНК-світ), оскільки це єдиний тип макромолекул, що можуть, у принципі, одночасно виконувати роль носіїв спадкової інформації та виступати каталізаторами. Пізніше більш стабільні молекули ДНК перебрали на себе роль носіїв інформації, а більш різноманітні за просторовою структурою білки – роль каталізаторів. Але у кількох важливих випадках (і спласинг – не

Рис. 7.7. Послідовна збірка сплайсосом на інтронах під час транскрипції.

єдиний приклад) рибозими виявилися еволюційно консервативними.

Сплайсосоми утворюються на інтронах пре-мРНК (і на CTD РНК-полімерази) послідовно під час транскрипції – майже відразу після синтезу сплайс-сайтів вони впізнаються відповідними елементами (рис. 7.7). При цьому СВС, що зв'язаний з кепом, підсилює ефективність зв'язування U1 у першому 5'-сплайс сайті – напевно, шляхом прямої взаємодії; вплив СВС на сплайсинг наступних інтронів послаблюється.

Швидкість збірки сплайсосом, таким чином, визначається швидкістю транскрипції. З іншого боку, зі сплайсосомою взаємодіють фактори елонгації транскрипції – наявність сплайс-сайта сприяє прискоренню руху полімерази. Такий процес синтезу РНК та її сплайсингу продовжується до того моменту, поки в складі пре-РНК не з'являється специфічна послідовність – сигнал термінації.