Промотор рнк-полімерази іі

Промотор РНК-полімерази ІІ, узагальнену схему якого представлено на рис. 6.3, може складатися з наступних елементів послідовності (для конкретних промоторів спостерігаються численні варіації цієї схеми). Проксимальні (приблизно у зоні –50 –200 пар основ відносно старту транскрипції) та дистальні (будь-де відносно старту) регуляторні елементи мають спорідненість до специфічних факторів транскрипції, взаємодія з якими активує/блокує збірку преініціаторного комплексу. Якщо дистальний елемент підсилює ефективність ініціації, його називають енхансером (enhancer – підсилювач), якщо навпаки – сайленсером (silencer – глушник). У зоні старту знаходиться так званий базальний промотор, на якому, власне, й відбувається збірка PIC.

Рис. 6.3. Приблизна узагальнена схема організації промотора РНК-полімерази ІІ та консенсусні послідовності основних елементів базального промотора.

Базальний промотор може включати (не обов'язково) три елементи: ТАТА-бокс (починається приблизно з –30 пари основ), ініціаторний елемент (Initiator, Inr) безпосередньо у зоні старту, DPE (Downstream Promoter Element) на відстані приблизно +30 пар основ від старту. Останні два елементи, Inr та DPE, як правило, присутні (якщо присутні) одночасно. Наприклад, приблизно 14% промоторів дрозофіли містять усі три елементи, 29% – тільки ТАТА-бокс, 26% – тільки DPE разом з Inr, 31% не містять жодного з трьох елементів. У останньому випадку промотор визначається іншими, більш специфічними елементами послідовності. Зокрема, досить часто зустрічається так званий GC-бокс, що розташований, як правило, трохи вище (upstream) відносно положення ТАТА-бокса.

Базальні фактори транскрипції

Послідовність збірки преініціаторного комплексу може бути різною, але усі базальні фактори мають бути присутніми у складі РІС для подальшого запуску транскрипції.

TFIID – один з найважливіших базальних факторів, який, зокрема, визначає впізнання стандартних елементів базального промотора (якщо вони присутні). Основою структури TFIID є ТВР (TATA-box Binding Protein) – білок зі специфічною спорідненістю до ТАТА-бокса. Досить широкий β-шар у складі ТВР взаємодіє з маленьким жолобком ДНК, наслідком чого є суттєва деформація подвійної спіралі з її розкручуванням та значним вигином у протилежний від білка бік (див. рис. 3.18). Саме з цього протилежного боку (всередині вигину) розташовуються інші білкові компоненти преініціаторного комплексу, які, таким чином, обгортаються промотором (див. нижче). Отже, вигин ДНК, який індукується ТВР, організує промотор і зв'язані з ним елементи у єдиний компактний комплекс і підтримує стабільність цього комплексу. Досить часто (але не обов'язково) зв'язування TFIID ініціює збірку РІС.

Із ТВР у складі TFIID зв'язані так звані ТВР-асоційовані фактори (TAFs – TBP Associated Factors) – 8 або більше білків (конкретний склад факторів варіює для різних промоторів). TAFs взаємодіють з ТВР та між собою, деякі з них здатні також взаємодіяти з ДНК. Зокрема, TAF_ІІ150 (або його аналог, 150 – молекулярна вага у кілодальтонах) впізнає DPE (рис. 6.4), тобто забезпечує зв'язування TFIID з базальним промотором, у складі якого відсутній ТАТА-бокс. Якщо у промоторі немає також і DPE, інші TAFs здійснюють білок-білкові взаємодії з факторами транскрипції, що зв'язані з іншими елементами послідовності. Наприклад, GC-бокс впізнається транскрипційним фактором

Рис. 6.4. Взаємодія TFIID з базальним промотором через ТВР (якщо присутній ТАТА-бокс), через один з TAFs (якщо присутній DPE), через інший TAF, що взаємодіє з транскрипційним фактором, зв'язаним з GC-боксом.

Sp1 (Specificity protein 1), який, у свою чергу, рекрутує TAF_ІІ110, що стає компонентом TFIID через взаємодію з TAF_ІІ250 (рис. 6.4).

Білок TAF_ІІ250 є практично обов'язковим компонентом TFIID (як і ТВР), виконуючи роль основного фактору збірки, з яким взаємодіють інші TAFs. Крім того, TAF_ІІ250 містить у своєму складі бромодомен та гістон-ацетилтрансферазну активність (розділ 4): відповідно, здатен як впізнавати ацетильовані гістони у зоні промоторів, так і здійснювати таке ацетилювання.

TFIIA – гетеродимерний білок, кофактор, що стабілізує комплекс ТВР з ДНК. Відповідно, цей фактор можна було б вважати ще одним TAF. В системах in vitro TFIIA не є необхідним для ініціації транскрипції, проте його відсутність у клітинах дріжджів є летальною.

Рис. 6.5. Комплекс із ДНК ДНК-зв'язуючого домена ТВР та С-кінцевої частини TFIIB у двох проекціях (1D3U).

TFIIB – мономерний білок із мультидоменною структурою. Два С-кінцевих домени взаємодіють з ДНК по обидва боки від сайта зв'язування ТВР, із внутрішнього боку вигину, який індукується цим білком (рис. 6.5). Таким чином, два білки, які взаємодіють також між собою, зв'язуються з ДНК кооперативно, підсилюючи спорідненість до неї один одного.

Два С-кінцеві домени TFIIB мають різну структуру і взаємодіють з різними елементами ДНК (маленьким та великим жолобками). Така асиметрія (існування двох альтернативних варіантів зв'язування з ДНК) відіграє роль у визначенні напряму транскрипції. Справа в тому, що N-кінцева частина TFIIB (практично не має регулярної вторинної структури) взаємодіє з РНК-полімеразою ІІ. Таким чином, саме TFIIB визначає положення полімерази на ДНК відносно стартової точки в одній з двох можливих орієнтацій ферменту.

Витягнута N-кінцева частина TFIIB взаємодіє з РНК-полімеразою у зоні активного центра, після початку транскрипції здійснює взаємодії з РНК-ДНК гібридом, а також блокує канал виходу РНК. Тобто, TFIIB певною мірою виконує функції, що є аналогічними до функцій бактеріального σ-фактора (розділ 5). Відповідно, TFIIB має бути звільненим при переході від ініціації до елонгації транскрипції (див. нижче).

TFIIF – гетеродимер, взаємодіє з РНК-полімеразою ІІ (зокрема, в зоні активного центра), з ДНК, з базальними факторами TFIIЕ та TFIIН. Після первинного плавлення ДНК при ініціації транскрипції TFIIF здійснює взаємодії з нематричним ланцюгом, стимулює роботу TFIIН (див. нижче), запобігає абортивній ініціації. Після завершення ініціації TFIIF разом з іншими базальними факторами дисоціює від РНК-полімерази, але може реасоціювати з нею під час елонгації – у випадку зупинки ферменту. Його роль як фактору елонгації транскрипції полягає у стимуляції продовження руху полімерази.

TFIIЕ – гетеродимер, стимулює роботу TFIIН, взаємодіє з транскрипційним міхуром при ініціації транскрипції.

TFIIН – найбільший з базальних факторів, складається з 10 субодиниць, має молекулярну вагу, порівняну з такою РНК-полімерази. TFIIН – єдиний базальний фактор, що має ферментативні активності. Перша з них – АТР-залежна ДНК-геліказна (гелікази – helicases – ферменти, що розкручують подвійну спіраль). Частина TFIIН взаємодіє з ДНК нижче від активного центра полімерази (по ходу транскрипції). Імовірно, конформаційні зміни білка, зумовлені гідролізом АТР, призводять до розкручування подвійної спіралі, і, оскільки вище від активного центру ДНК є жорстко зафіксованою, це розкручування призводить до локального плавлення дуплекса в зоні стартової точки. РНК-полімераза ІІ є единою з полімераз, яка потребує такої геліказної активності при ініціації транскрипції, – інші РНК-полімерази, еукаріотичні та бактеріальні, утворюють транскрипційний міхур завдяки певних ДНК-білкових взаємодій, яким сприяє негативна надспіралізація (див. розділ 5).

Друга ферментативна активність TFIIН – кіназна, за рахунок якої здійснюється фосфорилювання С-кінцевого домену РНК-полімерази при переході від ініціації до елонгації транскрипції. У дефосфорильованій формі (форма А РНК-полімерази), на стадії збірки преініціаторного комплексу, CTD взаємодіє з базальними факторами транскрипції; після фосфорилювання певних залишків Ser (форма О РНК-полімерази) ця взаємодія порушується.

Рис. 6.6. Схема взаємного розташування елементів у складі преініціаторного комплексу РНК-полімерази ІІ. Стрілкою позначено напрям транскрипції.

Медіатор. Ефективна збірка преініціаторного комплексу є можливою лише за участі ще одного структурного модуля – медіатора (mediator), який містить більше 20 субодиниць (склад варіює для різних промоторів – певний мінімальний набір субодиниць доповнюється більш специфічними за рахунок взаємодії з транскрипційними факторами). Цей мультибілковий комплекс має витягнуту структуру, яку можна розділити на три частини: голова (h, head), середня частина (m, middle) та хвіст (t, tail). Медіатор здійснює лише білок-білкові взаємодії: голова та середня частина взаємодіють з РНК-полімеразою, середня частина та хвіст – зі специфічними факторами транскрипції, що зв'язані на проксимальних та дистальних елементах промотора (рис. 6.6). Таким чином, медіатор є засобом передачі “активаційних сигналів“ з регуляторних елементів послідовності на РНК-полімеразу: збільшення кількості взаємодій підсилює ефективність збірки РІС.

Рис. 6.7. Процес ініціації транскрипції РНК-полімеразою ІІ.

Ініціація транскрипції РНК-полімеразою ІІ

Збірка преініціаторного комплексу є першою подією процесу ініціації. Схему будови комплексу представлено на рис. 6.6: ДНК (базальний промотор) довжиною приблизно 70 пар основ обгортає білкові компоненти РІС. При цьому промоторна ДНК зв'язана головним чином із базальними факторами транскрипції, не з полімеразою, зажим, що формується щелепами полімерази (рис. 6.1) не дозволяє розміститися дволанцюговій ДНК у щілині поблизу від активного центра.

На першому етапі ініціації, таким чином, утворюється закритий преініціаторний комплекс (рис. 6.7).

Наступна подія – утворення відкритого комплексу – локальне плавлення ДНК за рахунок геліказної активності TFIIH. Нематричний ланцюг після цього захоплюється фактором TFIIF, матричний – занурюється у активний центр, де взаємодіє також з N-кінцевою частиною TFIIВ. Починається синтез короткого первинного транскрипту, коротка гібридна подвійна спіраль стабілізується тим самим N-кінцевим доменом TFIIВ, який при цьому блокує канал виходу РНК.

На наступному кроці спрацьовує кіназна активність TFIIH: відбувається фосфорилювання, яке є точкою перемикання ініціації на елонгацію. CTD втрачає зв'язок із базальними факторами транскрипції, які дисоціюють від полімерази – відбувається очистка промотора. РНК-полімераза продовжує синтез РНК, а частина базальних факторів може залишатися на базальному промоторі й ініціювати зв'язування іншої полімерази.

Після термінації транскрипції (розділ 7) РНК-полімераза зв'язується з TFIIF, який рекрутує специфічну фосфатазу – відбувається дефосфорилювання CTD, і полімераза вступає у новий робочий цикл.

РНК-полімерази І та ІІІ

Ініціація транскрипції генів рибосомної РНК

Система ініціації транскрипції РНК-полімеразою І виглядає значно простіше. Промотор кожного кластера генів рибосомної РНК (рис. 6.8, див. також рис. 4.6) містить два елементи послідовності: кор-елемент у зоні стартової точки та UCE (Upstream Control Element) на відстані проблизно –100 пар основ від старту. Ініціація залежить від двох транскрипційних факторів: UBF (Upstream Binding Factor) та SL1, який позначають іноді як TFIB.

Рис. 6.8. Ініціація транскрипції РНК-полімеразою І.

Зв'язування UBF є передумовою ініціації, але цей фактор не має високої специфічності до елементів промотора: він зв'язується будь-де у межах рибосомного кластера. Димери UBF містять у своїй структурі HMG-бокси (див. рис. 3.17), які сприяють вигинам ДНК. У результаті зростає імовірність наближення у просторі двох елементів промотора, до яких має спорідненість SL1. Цей фактор є, насправді, аналогом фактора TFIID РНК-полімерази ІІ: він містить ТВР та певний специфічний набір асоційованих з ним факторів, від яких і залежить спорідненість SL1 до промотора рибосомного кластера. SL1 рекрутує до промотора РНК-полімеразу І, яка починає синтез попередника рРНК.

Таким чином, для РНК-полімерази І виконується та сама закономірність, що і для РНК-полімерази ІІ: незалежно від присутності чи відсутності ТАТА-бокса (який відсутній у промоторі RNAPI), ТВР має бути обов'язковим компонентом преініціаторного комплексу, сприяючи організації промоторної ДНК навкруг полімерази. Ця закономірність зберігається також і для РНК-полімерази ІІІ.