Метилювання днк

Рис. 6.27. Динуклеотид CpG у ДНК – субстрат метилювання.

Субстратом метилювання ДНК є цитозини (метильна група приєднується до п'ятого атому кільця з утворенням 5mC – 5-метилцитозину) у складі динуклеотидів CpG (рис. 6.27). Взагалі до 70-80% динуклеотидних контактів CpG є метильованими по обом цитозинам в еукаріотичному геномі. Зони, де підтримується деметильований стан CpG (CpG-острівці, див. розділ 4), часто розташовані у промоторах генів домашнього господарства – таких, що є активними незалежно від спеціалізації клітин.

Патерн тканьоспецифічного метилювання ДНК є результатом двох процесів: підтримання метильованого статусу після реплікації та метилювання de novo.

Підтримуюча ДНК-метилтрансфераза (DNA methyltransferase, Dnmt) спрацьовує протягом 1-2 хв після реплікації: дві дочірні молекули ДНК містять батьківскій ланцюг ДНК (з 5mС у складі CpG) та ланцюг, що синтезовано, де С не є метильованим. Dnmt впізнає такі напівметильовані динуклеотидні контакти і відновлює симетрію щодо метилювання С. За рахунок цього процесу патерн метилювання відтворюється у дочірніх клітинах, що є, поряд з відновленням модифікацій гістонів, одним з важливих механізмів епігенетичного спадкування.

Інші ДНК-метилтрансферази здійснюють метилювання ДНК de novo. Особливо важливим цей процес є на ранніх стадіях ембріонального розвитку, коли ДНК є тотально деметильованою. Пізніше здійснюється масове метилювання ДНК, що визначає специфічне вимикання певних груп генів при диференціюванні клітин. Крім того, деметилювання є можливим і в диференційованих клітинах, де Dnmt використовуються для відновлення метильованого статусу.

Отже, метилювання ДНК є ознакою репресованих та гетерохроматинових ділянок. Залучення 5mС до репресії пов'язане з наявністю у складі певних білків особливих структурних модулів – MBD (Methyl Binding Domain), що мають специфічну спорідненість до метильованих CpG динуклеотидів. Білки, що містять MBD, є компонентами різноманітних репресуючих комплексів. Зокрема, такі білки рекрутують до метильованих ділянок хроматину гістон-деацетилази. З іншого боку, деацетильований стан гістонових хвостів блокує деметилюючі активності, і навпаки – ацетилювання хвостів може викликати деметилювання ДНК у активних ділянках.

Аналогічно, білки, що містять MBD, рекрутують гістон-метилтрансферазу, яка здійснює метилювання Lys9 гістона Н3, що призводить до репресії (рис. 6.25, 6.26). І навпаки: Me-Lys9 впізнається білком, що містить хромодомен і рекрутує ДНК-метилтрансферазу.

Хоча Me-Lys9 та 5mС є загальними маркерами конститутивно репресованих ділянок хроматину, не завжди репресія та додаткова компактизація залежить від НР1 – реалізуються також інші системи, більшість з яких є ще не достатньо вивченими. Прикладом такої системи є інактивація однієї з Х-хромосом у клітинах самок ссавців. У складі Х-хромосоми, яка буде інактивованою (обирається випадково на ранніх стадіях розвитку), спрацьовує ген Xist, що продукує велику некодуючу молекулу РНК. Ця РНК вкриває собою хромосому і взаємодіє з низкою білків, серед яких – варіант гістона Н2А macroH2A. Імовірно, macroH2A рекрутує гістон-метилтрансферазу (здійснюється метилювання Lys9 гістона Н3) та гістон-деацетилазу. Метилювання Lys9, у свою чергу, зумовлює метилювання ДНК (що призводить до появи епігенетичної спадковості). Крім того, до Х-хромосоми рекрутуються структурні компактизуючі білкі (але не НР1).

РНК-інтерференція

Гетерохроматин утворюється в першу чергу на послідовностях ДНК, що повторюються. Причому має значення не послідовність як така, а саме наявність повторів. Виявляється, що у формуванні та підтриманні гетерохроматинового стану повторів (принаймні у центромерах) важливу роль відіграє процес так званої РНК-інтерференції (RNAi – RNA interference).

Взагалі процес РНК-інтерференції запускається будь-якою дволанцюговою РНК (dsRNA – double stranded RNA). Дволанцюгова РНК стає субстратом для РНКази, яка отримала назву Dicer (рис. 6.28): Dicer розрізає молекулу на дволанцюгові фрагменти довжиною 19-21 пари основ (по 2 нуклеотиди залишаються неспареними на кінцях). Ці фрагменти, які позначають як siRNA (short interfering RNA), можуть бути ампліфіковані РНК-залежною РНК-полімеразою (RdRP – RNA depended RNA Polymerase). Вони зв'язуються з кількома білками, утворюючи комплекс RISC (RNA Induced Silencing

Рис. 6.28. Посттранскрипційне вимикання гена завдяки РНК-інтерференції.

Complex). Один з білків має РНК-геліказну активність і розводить 2 ланцюги siRNA. Один з ланцюгів здійснює комплементарне спарювання з ділянкою мРНК, що синтезується у процесі транскрипції (звичайно, вихідна dsRNA має співпадати за послідовністю з кодуючою частиною даного гена), спрямовуючи туди RISC. Один з компонентів комплексу – РНК-аза Slicer – здійснює деградацію транскрипту. Крім того, RISC може індукувати активність RdRP для синтезу комплементарного ланцюга РНК на мРНК (чи її частині) у якості матриці. Відновлена дволанцюгова РНК буде знов підтримувати інактивацію гена шляхом інтерференції. Отже, хоча транскрипція відбувається, реалізується посттранскрипційне вимкнення гена (PTGS – posttranscriptional gene silencing).

РНК-інтерференція широко використовується останнім часом як дослідницький інструмент (за схемою на рис. 6.28): достатньо ввести в клітину синтетичну дволанцюгову РНК, послідовність якої ідентична послідовності певного гена, щоб запустити процес інтерференції, вимкнути ген і, таким чином, з'ясувати його функцію.

Рис. 6.29. РНК-інтерференція як механізм підтримання гетерохроматинового стану послідовностей ДНК, що повторюються.

У клітині РНК-інтерференція є однією з систем негативної регуляції експресії генів через використання так званих мікроРНК (miRNA). Активація генів мікроРНК (200-300 генів у геномі людини, які транскрибуються РНК-полімеразою ІІ) призводить до синтезу молекул РНК, що містять дволанцюгові шпильки. Ці шпильки (довжиною 25-35 пар основ) вирізаються нуклеазою і стають субстратом для Dicer. Результуюча дволанцюгова мікроРНК є аналогом siRNA: один з її ланцюгів є комплементарним до ділянки мРНК певного білкового гена, молекула мікроРНК зв'язується з білками RISC і спрямовує їх до мРНК-мішені. Результатом взаємодії з мРНК може бути її посттранскрипційна деградація (більш характерно для рослин), зупинка білкового синтезу (більш характерно для тварин – у цьому випадку взаємодія з мРНК відбувається у цитоплазмі), а також рекрутування до хроматину гістон-метилтрансфераз із наступною репресією даного гена. Дещо подібне відбувається і у гетерохроматині.

Участь РНК-інтерференції у підтриманні герехроматинового стану центромер ілюструє рис. 6.29. При порушенні компактизації на центромерних повторах може відбуватися спонтанна транскрипція у різних напрямах. Оскільки матрицею є повтори, існує висока ймовірність синтезу комплементарних молекул РНК: утвориться дволанцюгова РНК, яка запустить процес інтерференції. Крім деградації транскриптів, інтерференція має інший наслідок: RISC, який опиняється в зоні повторів, рекрутує до хроматину гістон-метилтрансферазу, що здійснює метилювання Lys9 гістона Н3. За вже відомою схемою (рис. 6.25, 6.26) відбувається зв'язування НР1 та компактизація гетерохроматину.