Молекулярна організація хроматину

Загальна довжина ДНК в ядрі еукаріотичної клітини – близько 2 м. Така кількість ДНК вимагає її щільної упаковки, яка зумовлює тотальне пригнічення функціональних активностей у більшій частині геному. Але при цьому упаковка ДНК у клітинному ядрі має дозволяти вибіркову активацію певних ділянок у певні моменти часу. Ці альтернативні завдання вирішуються завдяки тому, що ДНК існує в клітинному ядрі у вигляді складного нуклеопротеїнового комплексу – хроматину.

На першому рівні організації хроматину ДНК формує за рахунок взаємодії з білками елементарні утворення – нуклеосоми – із середньою щільністю одна нуклеосома на 200 пар основ. Білковий компонент нуклеосоми (кор) складається з 8 молекул корових гістонів Н2А, Н2В, Н3 та Н4 – по дві молекули кожного типу. На другому рівні компактизації за участю лінкерних гістонів Н1 утворюється так звана фібрила товщиною 30 нм. Хроматинова фібрила формує петлі розміром 20-200 тисяч пар основ, кінці яких є жорстко закріпленими на скелетних структурах ядерного матриксу.

Нуклеосома

Білковий компонент нуклеосоми – гістони, які є одним з найбільш еволюційно консервативних класів білків. Усі корові гістони (містять від 102 до 135 амінокислотних залишків) мають спільну схему будови. У первинній структурі виділяють дві частини: глобулярну та N-кінцеву невпорядковану (хвіст) довжиною від 20 (Н2А) до 40 (Н3) амінокислотних залишків. Гістон Н2А має також помітний С-кінцевий хвіст довжиною близько 15 залишків. Невпорядковані хвости практично не містять гідрофобних залишків, збагачені позитивно зарядженими амінокислотами і є субстратами для численних посттрансляційних модифікацій (див. нижче).

Глобулярна частина всіх корових гістонів, у свою чергу, також має спільну структуру. Вона виглядає як характерний триспіральний гістоновий мотив (histone fold), у якому одна довга α-спіраль фланкована двома короткими (див. рис. 3.16, а). Гістон Н3 містить також додаткову α-спіраль із боку N-кінця мотиву (αN-спіраль), а гістон Н2В – додаткову αС-спіраль. Гістоновий мотив не формує гідрофобного ядра, заекранованого від розчинника, – значна кількість гідрофобних залишків опиняється на поверхні. Унаслідок цього одна молекула корового гістона не може існувати як окремий глобулярний білок у водному середовищі. Мінімальними стабільними структурними одиницями є гетеродимери Н2А-Н2В та Н3-Н4 (мають подібну структуру, представлену на рис. 3.16, а). Два гістонових мотиви формують у складі димерів щільне гідрофобне ядро, а специфічність формування димерів залежить від наявності додаткових αN- та αС-спіралей у гістонах Н3 та Н2В відповідно.

На поверхні димера розташовані 3 зони скупчення позитивно заряджених амінокислотних залишків, які, за електростатичним механізмом, здатні взаємодіяти з ДНК. В межах кожного такого сайта знаходиться принаймні один залишок аргініну, що він відіграє найбільш важливу роль у взаємодії з ДНК. Разом ці три сайти створюють платформу для зв’язування ділянки ДНК довжиною 27-28 пар основ (~ 2,5 витка подвійної спіралі, рис. 3.16, а).

Рис. 4.9. Тетрамер гістонів (Н3-Н4)₂ у комплексі з ДНК у складі нуклеосоми (1KX5).

Два гетеродимери Н3-Н4 взаємодіють між собою за рахунок утворення чотириспірального пучка між гістоновими мотивами двох молекул Н3. У результаті формується тетрамер (Н3-Н4)₂ – комплекс, який займає центральну позицію в структурі нуклеосоми (рис. 4.9). Структура тетрамера нагадує підкову, яка характеризується хіральністю – утворює елемент лівої спіралі. Вісь симетрії тетрамерного комплексу (яка водночас є і віссю симетрії всієї нуклеосоми) проходить через інтерфейс між двома молекулами Н3.

Аналогічний за своєю структурою чотириспіральний пучок між гістоновими мотивами молекул Н4 та Н2В служить для забезпечення взаємодій між тетрамером (Н3-Н4)₂ та димером Н2А-Н2В. Таким чином, “підкова” тетрамера симетрично продовжується двома димерами Н2А-Н2В в обидва боки, результатом чого є утворення октамера (Н2А-Н2В-Н3-Н4)₂. Отже, глобулярні частини гістонів утворюють октамерний комплекс, який і служить білковим кором нуклеосоми (рис. 4.10). На глобулярній поверхні октамера існує своєрідний трек позитивно заряджених амінокислотних залишків, який використовується для взаємодії з нуклеосомною ДНК довжиною 145 пар основ.

Окрема нуклеосома (нуклеосомна кор-частинка) – октамер гістонів + 145 пар основ ДНК – може бути вилучена з хроматину за допомогою мікрококкової нуклеази: ця нуклеаза робить дволанцюговий розріз у ДНК, і, оскільки один з ланцюгів нуклеосомної ДНК завжди взаємодіє з гістонами (рис. 4.10), доступною для нуклеази є лише ДНК за межами нуклеосоми. У хроматині уся ДНК формує нуклеосоми із середньою щільністю 1 нуклеосома на 200 пар основ, сусідні нуклеосоми з'єднані міжнуклеосомними лінкерними (linker) ділянками. Нуклеосомна ДНК + лінкерна ділянка складають так званий нуклеосомний повтор, довжина якого (середнє значення 200 пар основ) варіює як уздовж полінуклеосомного ланцюга, так і в залежності від функціонального стану, типу клітин тощо.

Рис. 4.10. Структура нуклеосоми у двох проекціях (1KX5).

Вісь симетрії нуклеосоми проходить через центральну точку нуклеосомної ДНК, у якій великий жолобок подвійної спіралі є зверненим до поверхні октамера гістонів (рис. 4.10). ДНК-гістонові взаємодії здійснюються у позиціях, де маленький жолобок контактує з поверхнею октамера: саме тут реалізуються взаємодії ДНК із позитивно зарядженими сайтами на поверхні гістонових мотивів (порівн. рис. 3.16, а, 4.9, 4.10). Як видно з рис. 4.10, нуклеосомна ДНК є значно вигнутою на поверхні октамера гістонів і формує майже ідеальну ліву суперспіраль із радіусом 41,9 Å і кроком 25,9 Å. Центральні 133 пари основ такої суперспіралі дають 1,67 витка, решта нуклеосомної ДНК (дві ділянки по 7 пар основ на вході/виході) є практично прямою і просто продовжує хід нуклеосомної суперспіралі. Зрозуміло, що значний вигин нуклеосомної ДНК потребує енергетичних витрат, які компенсуються ДНК-гістоновими взаємодіями.

Структура нуклеосомної ДНК зумовлена її взаємодією із глобулярною частиною октамера гістонів. N-кінцеві хвости гістонів Н3 та Н2В виходять за межі нуклеосоми через канали, сформовані маленькими жолобками двох дуплексів сусідніх витків нуклеосомної суперспіралі (рис. 4.10). Ділянки хвостів, які безпосередньо розташовані в каналах, є позитивно зарядженими і, таким чином, додатково скріплюють сусідні витки суперспіралі. N-кінцеві хвости гістонів Н4 та Н2А також взаємодіють з маленьким жолобком зовні нуклеосомної суперспіралі. Особливе місце – входу/виходу нуклеосомної ДНК (рис. 4.10) – займає найбільш довгий N-кінцевий хвіст гістона Н3. Позитивно заряджений хвіст Н3 стабілізує структуру нуклеосоми в цій зоні, де спостерігається найвища щільність негативних зарядів ДНК.

Значна частина гістонових хвостів просто виходить за межі нуклеосоми. Завдяки своїй структурній лабільності вони приймають участь в організації хроматину на наднуклеосомному рівні, а також відіграють важливу роль платформи для зв’язування різноманітних білків, що залежить від посттрансляційних модифікацій хвостів (див. нижче).

Аналіз структури нуклеосоми та молекулярних механізмів її стабілізації дозволяє сформулювати наступні положення.

• Рис. 4.11. Роль проміжних акцепторів гістонів у збірці нуклеосоми: дисоціація гістонів є практично забороненою за фізіологічної іонної сили; у присутності акцептора взаємодія гістонів з ДНК стає рівноважною.

  Електростатичні взаємодії між ДНК та гістонами за фізіологічних умов є дуже міцними – остаточне руйнування нуклеосоми in vitro відбувається при концентрації солі 2 М. Тобто, за фізіологічних умов зв'язування гістонів з ДНК є необерненим (неможлива рівновага між зв'язаними та дисоційованими гістонами). Відповідно, хоча структура нуклеосоми відповідає мінімуму вільної енергії, цей мінімум неможливо досягти за розумний проміжок часу: гістони швидко та безладно зв'язуються з ДНК без подальшої дисоціації. Для реалізації рівноважних умов ДНК-гістонової взаємодії in vivo у хроматині існують проміжні акцептори гістонів, що виконують роль факторів збірки/руйнування нуклеосом. Ці акцептори мають спорідненість до гістонів трошки меншу, ніж спорідненість гістонів до ДНК (рис. 4.11), що й забезпечує можливість рівноважного обміну гістонами між ДНК та проміжними акцепторами із зсувом цієї рівноваги у бік ДНК-гістонових комплексів.

• Незважаючи на міцність ДНК-гістонових взаємодій, тимчасове їх порушення на кінцях нуклеосомної ДНК є можливим за фізіологічних умов: з одного боку, взаємодії на кінцевих ділянках є більш слабкими, ніж у центральній частині нуклеосомної ДНК; з іншого – висока щільність негативного заряду (контакт між сусідніми витками нуклеосомної суперспіралі) дестабілізує нуклеосому ДНК на виході з нуклеосоми. Це призводить до тимчасового часткового розкручування нуклеосомної ДНК на кінцях, що є одним з головних шляхів структурної динаміки нуклеосом.

• Наявність проміжних акцепторів гістонів призводить до можливості обміну димерами Н2А-Н2В між різними нуклеосомами: тимчасове видалення димерів є іншим важливим шляхом структурної динаміки хроматину.

• Незважаючи на те, що ДНК-гістонові взаємодії у нуклеосомі є неспецифічними щодо послідовності пар основ ДНК (електростатичні взаємодії між фосфатами ДНК та позитивними амінокислотними залишками), у хроматині спостерігається феномен переважного позиціювання нуклеосом відносно послідовності. Основною причиною позиціювання нуклеосом є залежність від послідовності здатності ДНК до деформацій, які супроводжують формування нуклеосоми (див. розділ 3). У результаті нуклеосома “обирає“ таку ділянку, де вигин ДНК потребує менших енергетичних витрат. Це призводить до важливих функціональних наслідків: диференційного експонування ділянок ДНК до дії регуляторних факторів (розділ 6).

• При функціонуванні хроматину виникає необхідність у змінах згаданого вище експонування/екранування певних ділянок ДНК – репозиціюванні нуклеосом. Міцність ДНК-гістонових взаємодій не дозволяє спонтанного зсуву нуклеосом вздовж ДНК, що зумовлює потребу в особливих АТР-залежних молекулярних пристроях, що здійснюють таке репозиціювання, – факторах ремоделювання хроматину (розділ 6), які також можуть виступати факторами збірки/руйнування нуклеосом.