Білково-нуклеїнові взаємодії

Структурна класифікація білків, що взаємодіють з ДНК

Так само, як більшість глобулярних білків можна вписати в обмежений набір стандартних укладок глобули (розділ 2), структурні елементи білків, які безпосередньо взаємодіють з ДНК можна розділити на досить обмежену кількість стандартних типів – ДНК-зв’язуючих структурних мотивів.

Рис. 3.12. НТН-мотив репресора бактеріофага λ у комплексі з ДНК (1LMB).

Мотив НТН (helix-turn-helix, спіраль-поворот-спіраль), приклад якого зображено на рис. 3.12, є найбільш розповсюдженим. Мотив складається з двох α-спіралей, часто приблизно перпендикулярних одна до одної, з’єднаних короткою перемичкою. Одна з цих спіралей (та, що впізнає) виконує роль “читаючої головки”, взаємодіючи з екзоциклічними групами азотистих основ у великому жолобку подвійної спіралі. Орієнтація цієї спіралі відносно ДНК може варіювати для різних білків, від приблизно перпендикулярної відносно осі подвійної спіралі до паралельної цукрофосфатному остову. Друга α-спіраль часто утворює допоміжні контакти з цукрофосфатним остовом. Взаємодія α-спіралі з великим жолобком часто зустрічається і для інших ДНК-зв’язуючих мотивів. Причина полягає у майже точній просторовій відповідності між цими двома елементами – можна сказати, що α-спіраль є просторово комплементарною до великого жолобка.

Двоспіральний НТН-мотив утримується в структурі того чи іншого структурного домену – у випадку репресора фага λ, у структурі α-спірального пучка (рис. 3.13, а). Часто білки, що містять НТН-мотив, взаємодіють з ДНК у вигляді гомодимера (дві однакові субодиниці) – це особливо характерно для прокаріотичних білків. Тоді дві однакові “читаючі головки” впізнають дві однакові послідовності, що симетрично розташовані у сайті взаємодії.

Інший приклад такого ж типу – катаболітний активаторний білок (CAP – Catabolite Activator Protein) Escherichia coli (рис. 3.13, б). При взаємодії гомодимера САР зі специфічним сайтом відбувається досить значний вигин ДНК у бік білка (подвійна спіраль “огортає“ білок). Спорідненість білка до цього сайта залежить від ліганду – сАМР (циклічного АМР – 5'-фосфат у складі нуклеотида утворює внутрішній ковалентний зв’язок з 3'-ОН групою рибози). Зв’язування сАМР індукує структурні зміни в молекулі білка (див. розділ 2), у результаті змінюється робоча поверхня, і білок набуває здатності впізнавати специфічну послідовність.

Рис. 3.14. Три цинкових пальця в складі ДНК-зв’язуючого білка (а, 1ZAA) і ДНК-зв’язуючий домен (димер) глюкокортикоїдного рецептора (б, 1GLU). Зелені сфери – іони Zn.

Рис. 3.13. Комплекси з ДНК гомодимерів репресора бактеріофага λ (а, 1LMB) і білка САР E. coli (б, 1CGP – зеленим кольором позначено молекули сАМР).

Розповсюджений клас білкових мотивів, що взаємодіють з ДНК, – Zn-координуючі мотиви. Це дуже невеличкі структурні елементи, які складаються з обмеженої, недостатньої для формування жорсткої глобули, кількості сегментів вторинної структури. Іон цинку надає жорсткості такому мотиву, утворюючи координаційні зв’язки з чотирма амінокислотними залишками, частіше Cys або His. Координаційний зв’язок формується неподіленою парою електронів атомів O, N або S, яка узагальнюється з атомом металу шляхом часткового “перетікання” на його низьку незаповнену орбіталь. Чотири такі зв’язки створюють жорсткий каркас, який утримує білкову поверхню, що має взаємодіяти з ДНК.

Один зі структурних мотивів такого типу, що часто зустрічається, – цинковий палець (Zn finger, рис. 3.14, а). Він має дуже просту будову: одна α-спіраль і маленький β-шар з двох β-ділянок; одна з них та α-спіраль містять залишки, що утворюють координаційні зв'язки з Zn. Як правило, кілька таких пальців (три на рис. 3.14, а), з’єднані перемичкою, спірально обгортають великий жолобок.

Інший приклад – ДНК зв’язуючий домен гормонового рецептора (рис. 3.14, б). Гормонові рецептори – це еукаріотичні фактори транскрипції, здебільшого гомодимери, які набувають споріденості до певних елементів послідовності ДНК після зв’язування з білком стероїдного гормону (розділ 6). ДНК-зв’язуючий домен має дві пари структурних елементів α-спіраль–суміжна нерегулярна петля, кожна пара координує іон Zn. Одна пара елементів приймає участь у димеризації, інша – у взаємодії з ДНК. Зустрічаються також інші Zn-координуючі мотиви, але всі вони, як і розглянуті, реалізують взаємодію α-спіралі з великим жолобком.

Рис. 3.15. Лейциновий зіпер (1NWQ).

Ще один мотив, який взаємодіє з великим жолобком ДНК за рахунок α-спіралей – лейциновий зіпер (Leu zipper, рис. 3.15). Він являє собою дві довгі α-спіралі, кожну з яких можна розділити на дві частини. Одна частина обох спіралей здійснює димеризацію – за рахунок гідрофобних взаємодій між неполярними амінокислотними залишками (часто Leu, звідки назва мотиву) утворюється трохи закручена подвійна спіраль (coiled coil). Друга частина кожної α-спіралі взаємодіє з великим жолобком ДНК.

Варіацією лейцинового зіпера є мотив спіраль-петля-спіраль (helix-loop-helix) – різниця лише в тому, що кожна довга α-спіраль розділена на дві коротші, з’єднані петлею: одна пара спіралей взаємодіє між собою, інша – з ДНК.

Все сказане вище не означає, що тільки α-спіраль використовується для взаємодії білків з великим жолобком ДНК. У великий жолобок добре укладається також β-шар з двох β-ділянок – саме такий шар є взаємодіючим елементом для білків типу метіонінового репресора. Численний клас білків складає родину імуноглобулін-подібних траскрипційних факторів (глобула має укладку імуноглобулінового типу, див. рис. 2.12, б), які реалізують взаємодії перемичок між ділянками β-структури з великим жолобком. Отже, хоча α-спіраль використовується частіше, реалізуються і всі інші можливості.

Рис. 3.16. Димер гістонів Н3-Н4 (а, 1AOI) та АТ-гак у складі білка HMGA (б, 2EZD).

Все сказане вище не означає також, що білки взаємодіють з ДНК тільки через великий жолобок (хоча через великий – частіше). На рис. 3.16 представлено приклади взаємодії перемичок між α-спіралями (а) чи витягнутого поліпептидного ланцюга (б) з маленьким жолобком. У першому випадку – димер гістонів у складі нуклеосоми (див. розділ 4) – маємо ще один структурний мотив, що зустрічається і в інших ДНК-зв’язуючих білках – гістонову укладку: одна довга α-спіраль фланкована двома короткими. Димер двох таких укладок взаємодіє з ~2,5 витками подвійної спіралі. У випадку гістонів ця взаємодія не є специфічною: утворюються електростатичні контакти позитивно заряджених амінокислотних залишків з фосфатами ДНК, але з боку маленького жолобка.

Рис. 3.17. HMG-бокс у складі білка HMGВ (1J5N).

Другий приклад (рис 3.16, б) стосується білків HMGA – білків групи високої рухливості (High Mobility Group) типу А (HMG – історична назва для білків різних структурних класів, мається на увазі рухливість при електрофорезі). Білки HMGA взагалі не мають глобулярної структури – є невпорядкованими. Вони містять 3 пентапептидні елементи (Pro-Arg-Gly-Arg-Pro), що називаються АТ-гаками (АТ-hook). Такий гак добре укладається у звужений маленький жолобок невеликої ділянки подвійної спіралі, збагаченої АТ-парами (тобто, АТ-гак має специфічність до невеликих АТ-збагачених сайтів, завдяки чому він і отримав свою назву).

Рис. 3.18. ДНК-зв’язуючий домен ТВР у комплексі з ТАТА-боксом (1QNE).

Наступні приклади стосуються дуже важливих випадків взаємодії елементів регулярної вторинної структури білків з маленьким жолобком. Оскільки α-спіраль та дволанцюговий β-шар добре укладаються у великий жолобок, це автоматично означає, що у маленькому жолобку їм не вистачає місця. Відповідно, така взаємодія буде можливою тільки за умови суттєвої деформації подвійної спіралі ДНК (розширення жолобка) – ефект, що має важливі функціональні наслідки. На рис. 3.17 представлено досить розповсюджений мотив – HMG-бокс, який, зокрема, входить до складу білків HMGВ (ще один клас білків HMG). Мотив складається з трьох α-спіралей, дві з них (позначені червоним) вбудовуються (інтеркалюють) у маленький жолобок. Це супроводжується розкрученням подвійної спіралі та вигином на ~80° у протилежний по відношенню до білка бік. Серед HMG-боксів є як специфічні до певних послідовностей пар основ, так і неспецифічні.

У складі білка ТВР (TATA-box Binding Protein) – важливого елемента ініціації транскрипції в еукаріотів – досить широкий β-шар взаємодіє з маленьким жолобком подвійної спіралі в зоні так званого ТАТА-бокса – регуляторного елемента послідовності ДНК (розділ 6). Наслідком цієї взаємодії також є значна деформація подвійної спіралі з її розкрученням та значним вигином у протилежний від білка бік. Вигин, як і у випадку HMG-бокса, підсилюється інтеркаляцією двох гідрофобних амінокислотних залишків між парами основ. У місці інтеркаляції порушуються стекінг-взаємодії та утворюється кінк (kink) – різкий злам подвійної спіралі.

Рис. 3.19. Комплекси з ДНК ДНКази І (а, 1DNK) та рестриктази EcoRV (б, 1AZ0).

На відміну від розглянутих вище факторів транскрипції та структурних білків, ферменти, що працюють на ДНК, досить важко описати у термінах простих структурних мотивів. Ферменти використовують складні комбінації різноманітних елементів білкової структури для впізнання ДНК та зв’язування з нею. Два приклади – мономерна ДНКаза І (неспецифічна ендонуклеаза, яка здійснює одноланцюговий розріз в області маленького жолобка) та гомодимерна рестриктаза EcoRV – представлені на рис. 3.19.

Принципи білково-нуклеїнового впізнання

Усі випадки взаємодії численних білків із ДНК можна розділити на дві категорії: неспецифічне зв’язування білка з ДНК будь-якої послідовності (характерна константа зв’язування K ~ 10⁵-10⁶ М^–1, визначення константи зв’язування див. у розділі 1) та специфічне впізнання білком певної послідовності пар основ (з константою ~10⁹-10¹⁰ М^–1). Білки, що здійснюють таке впізнання, як правило, взаємодіють і з будь-якою іншою ДНК неспецифічно. Розглянемо на простому прикладі, що практично означають наведені цифри.

Нехай у бактеріальній клітині радіусом 1 мкм міститься 10 молекул певного білка та 4600 тисяч пар основ ДНК, де присутня одна специфічна ділянка (оператор). Виходячи з об’єму клітини, можна легко розрахувати загальні молярні концентрації білка та оператора (скориставшись числом Авогадро). Концентрація комплексу з оператором визначається рівн. 1.6, де вільні концентрації білка та оператора дорівнюють їх загальним концентраціям мінус концентрація комплексу. Звідки, якщо відома K, можна розрахувати концентрацію комплексу.

Якщо білок зв’язується неспецифічно (K = 10⁵ М^-1), відношення концентрації комплексу до загальної концентрації оператора дорівнює 4·10^–4 – практично, оператор є вільним від білка. В той же час, якщо замість концентрації оператора використати загальну концентрацію потенційних сайтів зв’язування на ДНК (білок зв’язується будь-де), яка є в 4600 разів вищою (кожна пара основ потенційно може бути початком сайту зв’язування), то відношення концентрації комплексу до загальної концентрації білка дорівнює 0,995 – практично, білок увесь час є зв’язаним із ДНК.

При специфічному зв’язуванні (K = 10¹⁰ М^-1), відношення концентрації комплексу до загальної концентрації оператора дорівнює 0,97 – десяти молекул білка виявляється достатнім, щоб більшу частину часу оператор був зв’язаним. При цьому з оператором у нашому прикладі в даний момент часу може бути зв’язана лише одна молекула білка, решта знаходиться не у вільному стані, а на ДНК, взаємодіючи з нею неспецифічно.

Чим визначається висока специфічність зв'язування? Головне правило білково-нуклеїнового впізнання – відсутність жорстких правил. Розглянуті вище різні структурні мотиви білків є різними еволюційними рішеннями для специфічної взаємодії з тією чи іншою послідовністю: існує багато шляхів для того, щоб сформувати білкову поверхню для впізнання послідовності пар основ. Не існує і будь-якого коду впізнання – чіткої відповідності між амінокислотними залишками та парами основ. Але є певні загальні закономірності, частина яких вже має бути зрозумілою з розгляду ДНК-зв’язуючих структурних мотивів.

Зокрема, білково-нуклеїновий інтерфейс частіше представлений парою α-спіраль–великий жолобок завдяки хорошій просторовій відповідності між цими двома елементами. Проте використовуються також і β-структура, і перемички між елементами вторинної структури для впізнання пар основ у великому жолобку. Маленький жолобок також використовується для впізнання послідовностей пар основ, причому, у випадку взаємодії елементів вторинної структури білка (α-спіраль чи β-структура) з маленьким жолобком така взаємодія супроводжується розкриттям маленького жолобка. Таке розкриття стає можливим внаслідок значної деформації подвійної спіралі (розкручування, вигин, кінк внаслідок порушення стекінг-взаємодій).

На поверхні ДНК розташовані фосфатні залишки та донорно-акцепторні групи азотистих основ у жолобках. Саме ці групи і залучаються до контактів з амінокислотними боковими залишками та пептидними групами на поверхні білка.

Типи контактів (взаємодій) між ДНК та білками:

• 

  Рис. 3.20. Електростатичне зв'язування білка (червоним позначені позитивно заряджені амінокислотні залишки) з ДНК за рахунок визволення неорганічних катіонів.

  Електростатичні взаємодії між позитивно зарядженими амінокислотними залишками та негативно зарядженими фосфатами присутні майже завжди у білково-нуклеїнових комплексах. Зрозуміло, що електростатичні взаємодії відповідають за неспецифічне зв'язування. Як правило, вони додатково стабілізують також і специфічні комплекси. Електростатичне зв’язування білка з нуклеїновою кислотою має цілком ентропійну природу (див. також розділ 1). Висока концентрація негативних зарядів (фосфатів) на поверхні ДНК зумовлює формування навкруг ДНК “іонної атмосфери” з досить високою локальною щільністю катіонів (рис. 3.20). Зв’язування позитивно зарядженого білка призводить до визволення частки катіонів у зовнішній розчин, тобто до зростання невпорядкованості (ентропії) у системі. Енергетичний виграш від зв’язування білка (його спорідненість до ДНК) є тим більшим, чим меншою є концентрація солі у розчині, тобто різниця між концентрацією катіонів поблизу від ДНК та на віддаленні від неї.

• Водневі зв’язки між донорно-акцепторними групами білка та фосфатами й екзоциклічними групами азотистих основ. Водневі зв'язки, оскільки вони потребують чіткої взаємної орієнтації донора та акцептора, відіграють роль головного фактору специфічного впізнання. Кожна послідовність пар основ утворює у жолобках подвійної спіралі власний патерн донорних та акцепторних груп (рис. 3.21, див. також рис. 3.7), який і може впізнаватися поверхнею білка. Слід зазначити, що цей патерн є більш варіабельним у великому жолобку, де легше розрізнити пари основ та динуклеотидні контакти – і це ще одна причина, за якої саме великий жолобок частіше використовується для впізнання. Деякі амінокислотні залишки здатні утворювати два водневі зв'язки з азотистою основою, наприклад, Arg з гуаніном. Проте, Arg контактує і з усіма іншими основами. Чи буде певний залишок залученим до утворення водневого зв'язку, і якого саме, залежить від орієнтації цього залишку на поверхні.

  

  Рис. 3.21. Патерни донорів та акцепторів водневого зв'язку у жолобках подвійної спіралі для зазначеної послідовності чотирьох пар основ.

  Певні закономірності (своєрідний код, коли залишок певного типу у певному місці утворює зв'язок з певною основою) спостерігаються іноді тільки в межах однієї родини структурних мотивів, але і тоді такі закономірності не носять абсолютного характеру.

• Водневі зв'язки, опосередковані молекулами води. Вода, звичайно, взаємодіє з поверхнями як білків, так і ДНК. Визволення води з білково-нуклеїнового інтерфейсу вносить додаткову ентропійну складову у стабілізацію комплексу. Але досить часто окремі молекули води можуть залишатися в інтерфейсі, виконуючи роль біфункціональної зшивки – утворюючи водневі зв'язки з білковими групами та фосфатами або групами азотистих основ.

• Гідрофобні контакти можуть здійснюватись за участі метильної групи тиміну у великому жолобку (рис. 3.7), але більш суттєвими є гідрофобні взаємодії при інтеркаляції неполярних амінокислотних залишків між парами основ при деформації подвійної спіралі внаслідок занурення елементів вторинної структури білка у маленький жолобок (рис. 3.17, 3.18).

Головною умовою реалізації названих контактів між ДНК та білком є взаємна підгонка структури взаємодіючих елементів внаслідок відповідних конформаційних перетворень. Так, шляхом певних конформаційних змін подвійної спіралі (вигини спіралі, зміни твіста тощо) змінюється розмір жолобків, хімічні групи “підводяться“ під водневі зв'язки та міцні електростатичні контакти, збільшується загальна поверхня, що може взаємодіяти з білком. Тобто, для ефективного впізнання необхідна певна конформація подвійної спіралі та/або певні зміни цієї конформації. І те, й інше визначається послідовністю пар основ. Отже, основою для білково-нуклеїнового впізнання

Рис. 3.22. Структура ДНК-зв'язуючих доменів димера репресора лактозного оперона E. coli у комплексі з неспецифічною ДНК (а, 1OSL) та зі своїм специфічним оператором (б, 1L1M).

є структурно-динамічний поліморфізм нуклеотидних послідовностей – залежні від послідовності структурні особливості та конформаційна рухливість подвійної спіралі.

При цьому білок також часто потребує певної конформаційної підгонки під подвійну спіраль. Один з прикладів такої, досить значної, конформаційної зміни як у молекулі білка (формування додаткових α-спіралей), так і у молекулі ДНК (вигин подвійної спіралі) при утворенні специфічного комплексу представлено на рис. 3.22. Саме у процесі взаємної конформаційної підгонки білка та ДНК і реалізується специфічний патерн контактів у інтерфейсі між двома молекулами. Від того, наскільки легко потрібні конформаційні зміни відбуваються при зустрічі конкретного білка з конкретною послідовністю пар основ, залежить ефективність впізнання. Таким чином, головним механізмом впізнання послідовності ДНК білком є структурно-динамічна комплементарність двох молекул.