Полінуклеотидний ланцюг

Дві хімічні групи – ОН-група при 3'-атомі пентози одного нуклеотида та фосфат при 5'-атомі іншого – використовуються для утворення фосфодіефірного зв’язку між нуклеотидами (рис 3.4). Таким чином, як і поліпептидний (розділ 2), полінуклеотидний ланцюг має напрям. На одному його кінці залишається 5'-фосфат (5'-кінець), на іншому – 3' ОН-група (3'-кінець). Послідовності нуклеотидів прийнято записувати у напрямі 5' → 3', у тому ж напрямі відбувається синтез усіх нуклеїнових кислот. Слід також розуміти, що конформаційні особливості ланцюга залежать від напряму, в якому розташовані сусідні нуклеотиди. Наприклад, послідовність СА має інші особливості, ніж послідовність АС. Загалом у складі ланцюга може бути 16 типів таких динуклеотидних контактів (16 можливих комбінацій з чотирьох по два).

Отже, полярний остов полінуклеотидного ланцюга являє собою фосфатні залишки та пентози, що чергуються – цукрофосфатний остов. Від цього остова відходять азотисті основи як бокові залишки.

Рис. 3.4. Полінуклеотидний ланцюг. Зверху праворуч: два варіанти схематичного зображення ланцюга, вертикальна лінія позначає пентозу, Р – фосфатний залишок.

Нуклеази

Деградація нуклеїнових кислот відбувається при різноманітних функціональних процесах шляхом гідролізу фосфодіефірного зв’язку в реакції, яка каталізується спеціальними ферментами – нуклеазами. Нуклеази розділяють на різні типи за певними ознаками:

• РНКази та ДНКази є специфічними до відповідних нуклеїнових кислот.

• Екзонуклеази відщеплюють один нуклеотид від одного з кінців ланцюга. Відповідно, розрізняють 5'- та 3'-екзонуклеази. Ендонуклеази гідролізують фосфодіефірний зв’язок всередині ланцюга.

• Серед ендонуклеаз, які мають своїм субстратом дволанцюгову молекулу ДНК (див. нижче), є такі, що роблять одноланцюговий розріз – нік (nick), залишаючи інший ланцюг інтактним. Інші здійснюють дволанцюгові розрізи.

• Серед ендонуклеаз є неспецифічні щодо послідовності нуклеотидів. Але є також велика група бактеріальних ферментів – рестриктаз – які діють лише на певні невеличкі (частіше 4 або 6 нуклеотидів) елементи послідовності. Рестриктази виконують у бактеріальній клітині роль захисту від чужорідної ДНК бактеріофагів і широко використовуються як інструменти дослідження в молекулярній біології (див. розділ 11).

Реакція гідролізу фосфодіефірного зв’язку є енергетично вигідною. З цього випливає, що нуклеотид (нуклеозидмонофосфат) не може бути використаним для синтезу нуклеїнової кислоти – натомість до реакцій синтезу залучаються відповідні нуклеозидтрифосфати (розділи 5, 6, 9).

Подвійна спіраль Стабілізація подвійної спіралі

Рис. 3.5. Схема об’єднання двох динуклеотидів у дволанцюгову структуру.

Два полінуклеотидні ланцюги (ДНК, РНК або гібридні) можуть об’єднуватись в єдину дволанцюгову структуру (дуплекс), схема якої представлена на рис. 3.5. Таке об’єднання відбувається за жорсткої умови: певні азотисті основи повинні стояти одна проти одної – А проти Т (чи U), G проти C. Цей принцип комплементарності, сформульований Уотсоном і Кріком (James D. Watson, Francis H. C. Crick), зумовлений утворенням специфічних водневих зв’язків між названими основами: два зв’язки в парі А-Т, три в парі G-C. Два ланцюги при цьому спрямовані у різні боки (є антипаралельними), цукрофосфатні остови розташовані зовні, пари основ – всередині цієї структури.

Рис. 3.6. Два варіанти представлення подвійної спіралі ДНК (кристалічна структура додекамера, 355D).

У складі такого дволанцюгового комплексу неполярні площини сусідніх пар основ мають наблизитися одна до одної, і відносна гнучкість остовів дозволяє це зробити простим шляхом – закрутити два ланцюги один навкруг одного у подвійну спіраль (рис. 3.6). Всередині формується стопка (stack) щільно укладених одна на одну пар основ, захищена на поверхні спірально закрученими один навкруг одного полярними цукрофосфатними остовами. Між остовами на поверхні спіралі утворюються два жолобки різного розміру – великий та маленький (major/minor groove), в які дивляться донорно-акцепторні групи азотистих основ (рис. 3.7): у великому жолобку знаходяться по два акцептори (O, N) та одному донору (NH₂) водневого зв’язку кожної пари; у маленькому – два акцептори пари А-Т, два акцептори та один донор пари G-C.

Таким чином, цілком подібно до білків (розділ 2), гідрофобні взаємодії (розділ 1) між площинами пар азотистих основ зумовлюють формування подвійної спіралі. При цьому реалізується щільна упаковка – утворюються вандерваальсові контакти між сусідніми парами. Велика кількість таких контактів вздовж осі спіралі робить їх суттєвим фактором стабілізації дуплекса. Вандерваальсові взаємодії між парами основ є за своїм характером орієнтаційними та, внаслідок нерівномірності розподілу електронної щільності по кільцям основ, диполь-дипольними (див. розділ 1). Такі взаємодії складного характеру (гідрофобний ефект + вандерваальсові взаємодії) у складі стопки мають спеціальну назву – стекінг-взаємодії.

Рис. 3.7. Комплементарні пари основ у складі ДНК з водневими зв’язками між основами. Праворуч: атоми тих самих пар зображені відповідно до їх вандерваальсових радіусів.

Отже стекінг-взаємодії – головний фактор стабілізації подвійної спіралі. Точніше, це практично єдиний фактор стабілізації. Роль комплементарних водневих зв’язків між основами, які самі по собі є не дуже важливими енергетично (водневі зв’язки основ з водою при розходженні ланцюгів майже анітрохи не гірші), полягає в тому, що вони є необхідною передумовою утворення стабільної стопки. Це знову цілком аналогічно до ролі водневих зв’язків між пептидними групами вторинної структури білків у стабілізації глобули (розділ 2). Донорно-акцепторні групи азотистих основ прагнуть утворити водневі зв’язки (енергія водневого зв’язку є надто високою, щоб його втрачати). Опиняючись всередині неполярної стопки, ці групи стають недоступним для води, і єдиний шанс зберегти водневі зв’язки – утворити їх з відповідними групами іншої основи. А це можливо лише за умови комплементарності. Відповідно, за відсутності комплементарності зберігаються водневі зв'язки з водою, і подвійна спіраль є нестабільною.

Ефективність стекінг-взаємодій залежить від типу контактуючих пар основ, а також їх взаємної орієнтації та порядку розташування у ланцюгах дуплекса – типу динуклеотидного контакту вздовж осі подвійної спіралі. Замість 16 типів динуклеотидних контактів у одноланцюговій нуклеїновій кислоті, у подвійній спіралі залишається 10 – внаслідок комплементарності ланцюгів певні контакти є еквівалентними один до одного. Наприклад, контакт AG в одному ланцюзі автоматично означає, що у комплементарному ланцюзі реалізується контакт CT – слід пам’ятати, що ланцюги є антипаралельними, і що послідовність нуклеотидів читається у напрямку 5' → 3' (усі динуклеотидні контакти подвійної спіралі перелічені у табл. 3.2). Для певних контактів (наприклад, пурин-піримидинових у порівнянні з піримидин-пуриновими) стекінг-взаємодії є більш ефективними. Відповідно, стабільність подвійної спіралі залежить від послідовності пар основ.

Утворення подвійної спіралі, звісно, працює проти конформаційної ентропії: розходження двох ланцюгів супроводжується значним зростанням їх конформаційної свободи (невпорядкованості). Відповідно, стабільність подвійної спіралі залежить від температури: при зростанні температури ентропійна компонента вільної енергії збільшується (рівн. 1.2), і відбувається розходження ланцюгів – плавлення подвійної спіралі. Зрозуміло, що температура плавлення – температура за якої 50% пар основ є розплавленими – є мірою стабільності, і залежить від послідовності пар основ.

Суттєвий дестабілізуючий внесок у вільну енергію подвійної спіралі дають також електростатичні взаємодії. Оскільки кожен фосфатний залишок несе на собі негативний заряд (рис. 3.4), молекула ДНК є гігантським поліаніоном із високою поверхневою щільністю зарядів. У розчині ці заряди суттєво нейтралізовані протиіонами – неорганічними катіонами: навкруг ДНК утворюється “іонна атмосфера” з досить високою локальною щільністю катіонів. Тобто, в системі виникає нерівномірний розподіл катіонів – зростає відповідна ентропійна компонента вільної енергії. Цей невигідний ефект буде тим меншим, чим більш високою є концентрація солі у розчині, тобто різниця між концентрацією катіонів поблизу від ДНК та на віддаленні від неї. Відповідно, стабільність подвійної спіралі (і температура плавлення) залежить від іонної сили розчину – зростає при підвищенні концентрації солі.

За фізіологічних умов подвійна спіраль є досить стабільною структурою, і саме в цій формі ДНК (і значна частина комплементарних одна до одної ділянок РНК) існує в живих системах. Відповідно, розходження ланцюгів, яке має тимчасово відбуватися при різноманітних функціональних процесах, потребує виконання роботи молекулярними машинами з використанням енергії гідролізу АТР.