21

Системы клонирования в клетках е. Coli

Плазмидные векторы. Первые плазмидные векторы pSC101 и ColEl представляют интерес лишь с исторической точки зрения. Они оба несут по одному сайту узнавания для рестриктазы EcoR1 и использовались для клонирования EcoR1-фрагментов ДНК. С этой целью кольце­вые векторные молекулы сначала линеаризовали рестриктазой, в результате чего образовывались 5'-выступающие однонитевые концы 5'-ААТТ-3'. Такие же концы имелись и у фрагментов чужДНК, что позволяло объединять эти молекулы благодаря их комплемен­тарным взаимодействиям и восстанавливать ковалентные связи с помощью ДНК-лигазы. Отметим, кстати, что одновре­менно было предложено синтезировать комплементарные концы у взаимодействующих молекул ферментативными методами. Эти процедуры получения рекДНК стали с тех пор классическими, ознаменовав начало истории генетичес­кой инженерии.

Плазмида pSC101. Ее размер 9,1 т.п.н. Она низкокопийна и содержит ген устойчивости к тетрациклину. При разрезании ее рестриктазой EcoRI репликативные гены и детерминанта устойчи­вости к антибиотику не затрагиваются. Поэтому трансформанты с плазмидой отыскивают по селективному маркеру. Однако найти среди них клетки с рекДНК можно только при наличии в клони­руемом гене селективных свойств, что является недостатком этого вектора. С его помощью были впервые осуществлены в клетках Е. coli экспрессия чужеродного гена (гена Ар^R плазмиды р1258 золотистого стафилококка) и клонирование эукариотической ДНК (гена рибосомной РНК из ооцитов шпорцевой лягушки). Во втором случае клоны с рекДНК были выявлены рестрикционным анализом плазмид, выделенных из трансформантов. Область использования вектора pSC101 и его производных (как, собственно, и других малокопийных векторов) — это клонирование таких генов, про­дукты которых в большом количестве приводят к серьезным на­рушениям нормального клеточного метаболизма.

Плазмида ColE1. Эта плазмида оказалась более удобной. Она, во-первых, мультикопийна, причем инкубация клеток в присут­ствии ингибиторов синтеза белка (хлорамфеникол, спектиномицин и др.) доводит число ее копий на клетку до 3000. Это позволяет выделять из 1 л культуры клеток до 1 мг плазмидной ДНК. Во-вторых, клонируемый с ее помощью фрагмент, интегрируясь в ColEl ДНК через EcoRI-сайт в гене сеа, нарушает синтез колицина. Бактериальные клетки, трансфор­мированные этой плазмидой, распознают по устойчивости к колицину, обусловленной геном imm, а клоны с рекДНК отличают по отсутствию в них синтеза колицина. Однако и плазмида ColEl не нашла широкого применения в качестве вектора, так как ее признак иммунитета является пло­хим селективным маркером. Поэтому в последующие годы на ее основе, а также на базе репликонов мультикопийных природных плазмид — рМВ1 (родственна плазмиде ColEl и несовместима с ней) и Р15А (совместима с ColEl) были сконструированы производные векторы, содержащие высокоселективные маркеры устой­чивости к антибиотикам других плазмид. Примером подобного конструирования может служить схема создания многоцелевого вектора pBR322, до сих пор широ­ко используемого в лабораторной практике.

Векторы pUC. Широкое распространение получили векторы серии pUC. Они были сконструированы в лаборатории Мессинга и предназначены для клонирования и экспрессии генов. Копийность этих векторов достигает 500 на клетку. Их удобство заключается в том, что селективным признаком для отличия вектора от рекДНК служит Lac-фенотип реципиентных клеток. Основа векторов pUC — часть плазмиды pBR322, содержащая ori-сайт и ген Ap^R, а их "изюмина" — экспрессионные кассеты, взятые из однонитевых векторов М13mр. Экспрессионной кассетой называ­ют блок регуляторных последовательностей, обеспечивающих транс­крипцию клонируемых генов. В векторах М13mр и pUC в эту кассету входят регуляторная часть lас-оперона (в том числе и ген-репрессор lac1) и начальная часть гена lacZ (локус lacZ'), кодиру­ющая так называемый a-пептид β-галактозидазы, состоящий из 145 аминокислот. Этот пептид способен комплементировать in vivo де­фектный бактериальный белок β-галактозидазу, у которой отсут­ствуют аминокислоты с одиннадцатой по сорок первую в N-концевой части. В результате трансформация плазмидой pUC клеток, имеющих час­тичную делецию начальной части гена lacZ, приводит к измене­нию их фенотипа от Lac'K Lac⁺(эффект а-комплементации).

Для создания в локусе lacZ' сайта клонирования в нем был сначала образован EcoRI-сайт. С этой целью методом локализо­ванного мутагенеза в 5-м кодоне гуанин был заменен аденином:

4 5 6 EcoRl

ACG:GAT:TCA ——» ACG:AAT:TCA,

что привело к смене аспартата на аспарагин в а-пептиде, но не нарушило его комплементационную активность. В образовавшийся сайт можно вводить полилинкеры с числом нуклеотидных пар, кратным трем. При этом комплементационная активность а-пептидов сохраняется на прежнем уровне, так как сдвига рамки счи­тывания при трансляции не происходит. Интеграция чужДНК в вектор через полилинкер вызывает инактивацию а-пептида, что позволяет отбирать среди ампициллин-устойчивых трансформан­тов клоны с рекДНК по Lac^- фенотипу реципиентных клеток. Близость лактозного промотора к полилинкерам обеспечивает воз­можность экспрессии в векторах pUC генов, клонированных с помощью различных рестриктаз. Система с а-комплементацией оказалась настолько удобной и эффективной, что стала применяться во многих других векто­рах — плазмидных и фаговых.

Векторы прямой селекции. Такие векторы содержат ген (или сайт), продукт которого (или сама последовательность) в опреде­ленных условиях является "ядом" для клеток. Мишенью может быть ген-репрессор, контролирующий ген антибиотикоустойчивости или цитотоксические гены (например, kil, ccd), находящиеся под строгим контролем. Инактивация подобных генов внедрением в них чужДНК позволяет трансформантам выжить в этих условиях. Основное затруднение при работе с такими векторами связано с не­обходимостью использовать специальные штаммы бактерий или сре­ды. Другой недостаток этих векторов — невозможность во многих случаях использования полилинкеров, так как их введение обычно инактивирует ген. Наиболее практичен вектор pLX100, содержащий ген ксилозоизомеразы xylA под контролем лактозного промотора. Вы­сокий уровень концентрации этого фермента не позволяет клеткам Е. coli расти на минимальных средах с ксилозой. Внедрение чужДНК в ген xylA через единичные сайты BamHI, HindIII, PstI или XhoI инактивирует этот ген и способствует выживанию только транс­формантов, имеющих рекомбинантную плазмиду.

Векторы pGEM. Описанные плазмидные векторы пригодны лишь для клонирования генов в клетках Е. coli и родственных им грамотрицательных бактерий, например, Salmonella и Serratia. Они универсальны — их используют для самых разнообразных целей. В то же время сконструировано много специальных векторов, при­способленных, например, только для идентификации регуляторных сигналов, для суперпродукции чужеродных белков и их сек­реции, для секвенирования ДНК, экспрессии генов животных в бактериях и т. д. Oтметим особенность современных векторов, предлагаемых фирмами. Они, во-первых, содержат полилинкеры, причем для удобства пользования их внедряют в противополож­ных направлениях. Таким образом, векторы выпускаются парны­ми, что отражается в порядковом номере при их названии. Во-вторых, у векторов на концах полилинкеров находятся промоторы фагов SP6, Т3 и/или Т7. Это позволяет осуществлять транскрип­цию клонированного гена in vitro в обоих направлениях с целью использования транскриптов в качестве гибридизационных зон­дов или для транслирования в белок-синтезирующей системе. При­мером могут служить векторы pGEMl и pGEM2.

Трансформация клеток Е. соli. Плазмидные векторы и рекДНК, сконструированные на их основе, вводят в реципиентные клетки методом генетической трансформации, т. е. путем обработки кле­ток изолированной ДНК. Возможность трансформации бактерий зависит от их компетентности, т. е. от способности пропускать ДНК через клеточную стенку. Для некоторых родов бактерий (Bacillus, Haemophilus, Pseudomonas, Streptococcus, Streptomyces и др.) состоя­ние компетентности естественно. В большинстве же случаев его приходится вызывать искусственно. Наиболее распространены об­работка клеток двухвалентными катионами "на холоду" и электропорация (пробой клеточной стенки электрическим током). Из­вестно также, что последовательные циклы замораживания и оттаивания ослабляют клеточную стенку и делают ее проницаемой для вхождения ДНК в клетку. Трансформацию клеток Е. coli плазмидами можно вести лю­бым из вышеперечисленных методов, но наиболее распространен благодаря своей простоте так называемый кальциевый метод. Он основан на факте, что клетки, выдержанные на холоду, в присутствии хлори­стого кальция становятся компетентными для их трансформации (трансфекции) изолированной ДНК фага А.