Технологическая схема получения гибридом, синтезирующих моноклональные антитела

1. Получение миеломных клеток.

2. Иммунизация мышей антигеном.

3. Получение В-лимфоцитов.

4. Гибридизация клеток миеломы и В-лимфоцитов.

5. Селекция на среде ГАТ.

6. Определение антителобразующей способности гибридом.

7. Накопление клона гибридом, синтезирующих моноклональные антитела заданной специфичности (к известному антителу).

8. Крупномасштабное культивирование гибридом и накопление моноклональных антител.

9. Концентрирование, выделение и очистка моноклональных антител.

1. Получение миеломных клеток.

Миеломные клетки выделяют от крыс или мышей. Клетки миеломы (плазмоциты) – это злокачественно трансформированные лимфоидные клетки костного мозга, представляющие собой клоны, образованные при делении единичных измененных опухолевых В-клеток, каждый из которых синтезирует моноклональные антитела неизвестной специфичности и обладает способностью к неограниченному размножению in vivo и in vitro.

2. Иммунизация мышей антигеном.

Иммунизацию проводят с целью формирования иммунного ответа и образования антител. Антиген вводят внутривенно, внутрибрюшинно или подкожно с адъювантом или без него в нарастающей дозе.

3. Получение клеток селезенки.

Селезенка наиболее богата плазматическими клетками, синтезирующими антитела. Через 4 дня после последней иммунизации мышей убивают, извлекают селезенку, измельчают и готовят суспензию, в специальной среде культивирования. В состав среды входят аминокислоты, витамины, углеводы, неорганические соли.

4. Гибридизация клеток миеломы и в-лимфоцитов селезенки

Клетки смешивают, осаждают центрифугированием. Слияние суспензии клеток селезенки и миеломных клеток проводят в присутствии ПЭГ и кальция хлорида, которые обеспечивают контакт и слияние клеток за счет сближения клеток и образования между клетками кальциевых каналов. Слияние продолжают 30-40 мин при 37⁰С, затем клетки опять центрифугируют. Частота слияния – 1 гибридная клетка на 100 000 клеток.

5. Селекция гибридом на среде гат.

Полученный осадок ресуспендируют в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин, тимидин (ГАТ). Разливают в лунки микропланшет и инкубируют при 37⁰ С в атмосфере углекислого газа в течение 10-16 дней. Каждые 3-4 дня проводят замену питательной среды на новую того же состава.

В предложенной среде выживают и размножаются только слившиеся гибридные клетки, а отдельные миеломные клетки и лимфоциты погибают. Быстрорастущие клоны гибридом хорошо различимы в виде плотных колоний на дне планшет.

6. Определение антителобразующей способности гибридом.

Наличие антител определяют в надосадочных фракциях культуральной среды в лунках микропланшет, отбирают пипеткой пробы и концентрацию антител определяют высокочувствительными методами радиоиммуноанализа (РИА) или иммуноферментного анализа (ИФА).

7. Клонирование гибридом.

Обнаруженные антителобразующие клоны должны быть сразу реклонированы.. Клетки гибридом ресуспендируют в синтетической среде обычного состава с добавлением сыворотки крови плода коровы и затем разводят этой же средой так, чтобы в одну лунку микропланшет попала только одна гибридома, из которой формировался бы один клон клеток. Данный метод носит название - метод предельных разведений.

8. Накопление клеток, синтезирующих моноклональные антитела.

Размножившиеся клоны гибридных клеток переносят в планшеты с лунками больших размеров, а затем в культуральные сосуды объемом 25-50 мл. Подготовленную массу гибридом используют для промышленного культивирования.

9. Крупномасштабное культивирование гибридом и накопление моноклональных антител.

Существуют различные способы выращивания гибридом. Первый способ – это выращивание в виде трансплантируемой опухоли у мышей гистосовместимой линии. Для чего внутрибрюшинно каждому животному вводят по дозу гибридом и через определенное время проводят забор внутрибрюшинной асцитной жидкости. Содержание моноклональных антител в ней колеблется от 1 до 25 мг/л.

Данный метод получения моноклональных антител является дорогостоящим, так как требует больших затрат на содержание лабораторных животных в асептических условиях. Кроме того для получения 1 кг целевого продукта необходимо использовать несколько тысяч животных. Поэтому в настоящее время предпочтение отдают культивированию гибридом в биореакторах. Выход целевого продукта значительно увеличивается (до 250 мг/мл), а стоимость снижается.

В настоящее время созданы специальные системы интенсивного культивирования гибридом в течение 1-2 месяцев. По истечении этого времени проводят новое клонирование гибридом, так как по истечении времени гибридомы теряют способность продуцировать антитела.

Способы крупномасштабного культивирования гибридом:

1. Инкубирование в аппаратах эрлифтного типа гибридомных клеток. Культивирование проводят в среде газовой смеси углекислого газа и воздуха. Данный способ культивирования имеет один недостаток – разрушение значительного количества клеток продуцентов.

2. Инкубирование в аппаратах эрлифтного типа иммобилизированных гибридомных клеток. Иммобилизацию проводят на стеклянном матриксе, заключением в микрокапсулы из агарозы, альгината (до 250 мг/мл), стабилизированного кальцием, альгината поли-L-лизина. Последний носитель проницаем для метаболитов, но не для молекул антител. Поэтому после завершения процесса культивирования микрокапсулы отделяют, размыкают и получают чистые антитела (из 30 л – 10 г).

3. Культивирование с использованием мембранно-перфузионных систем. Гибридомы помещают в пространство полых волокон, через которые проходит питательная среда. Это позволяет повысить стабильность продуцентов и увеличить выход антител.

Для увеличения выхода моноклональных антител постоянно совершенствуется состав питательных сред. Идет замена сыворотки крови КРС на комплекс низкомолекулярных БАВ и гормонов.