Иммуноэлектрофорез

Иммуноэлектрофорез позволяет разделять сложные смеси антигенов, например антигены, содержащиеся в сыворотке крови.

1. Разделение осуществляют в агаровом геле, помещенном в электрическое поле, причем рН геля устанавливают так, что­бы положительно заряженные белки перемещались к катоду, а отрицательно заряженные - к аноду.

2. Между лунками вырезают канавку, которую заполняют рас­твором антител, диффундирующих в гель.

3.Антигены и антитела формируют дуги преципитации.

Реакция проводится в два этапа: вначале проводят электро-форетическое разделение смеси белков. По окончании электро­фореза в канавку вносят антисыворотку. Антиген и антисыворот­ка диффундируют навстречу друг другу, образуя дугообразные линии преципитации. Количество, форма, положение этих линий характеризуют антигенный состав исходного биоматериала (в данном случае сыворотки).

Сущность: заключается во взаимодействии мелкодисперсных антигенов с соответствующими антителами и образование преципитата

Иммунодиффузия продолжается не менее 24 ч при указанной в методике силе тока. После иммунодиффузии пластины высу­шивают, окрашивают и интерпретируют результаты.

Чувствительность метода - более 100 мкг/мл.

Специфичность метода зависит от чистоты антисыворотки (поликлональная, моноклональная). Качество исследования по­вышается при использовании полностью автоматизированных систем.

Иммуноэлектрофорез широко распространен в лабораторной практике для исследования белков сыворотки, СМЖ, мочи, экс­трактов из органов. Наибольшее значение имеет при диагностике парапротеинемий и иммунодефицитных состояний. Метод широ­ко используется для характеристики чистоты препаратов в фар­мацевтической промышленности, производстве вакцин, применяется для определения активности антитоксической сыворотки.

Встречный электрофорез проводят в агаровом геле, рН ко­торого устанавливают так, чтобы антитела (Ат) несли суммарный отрицательный заряд, а исследуемый антиген (Аг) - положитель­ный. В электрическом поле антиген и антитела движутся на­встречу друг другу и преципитируют. Принцип метода тот же са­мый, что и при двойной иммунодиффузии, однако чувствитель­ность выше в 10-20 раз.

Ракетный электрофорез позволяет количественно опреде­лять антиген в антителосодержащем геле, рН которого подбирают с расчетом, чтобы движения антител не происходило, а антиген нес суммарный отрицательный заряд. Линия преципитации очерчивает область в виде ракеты, длина которой пропорциональна концентрации антигена. Определить эту концентрацию можно по калибровочной кривой. Оба метода основаны на различаи суммарных зарядов антигена и антител при выбранном pH.

РАДИОИММУННЫЙ АНАЛИЗ (РИА)

Радиоиммунный анализ (РИА)

Радиоиммунный метод применяется с целью количественно­го определения различных веществ - гормонов, белков сыворот­ки крови, микробных антигенов.

Метод позволяет выявить незначительные количества анти­гена. При радиоиммуноанализе необходимо строгое соблюдение правил работы с изотопами (защита, условия труда, утилизация отходов).

Жидкостный радиоиммунный анализ

Очищенный известный антиген метят радионуклидами. При конкурентном варианте связывания для определения количества антигена в исследуемом образце определяют его способность конкурировать с меченым референс-антигеном в связывании со специфическими антителами, образуются иммунные комплексы антиген-антитело, которые осаждают сульфатом аммония или ан­тиантителами, определяют радиоактивность, сравнивают с ра­диоактивностью несвязавшегося антигена. С помощью стандарт­ной калибровочной кривой устанавливают концентрацию иссле­дуемого антигена.

Твердофазный радиоиммунный анализ

Специфические антитела фиксируются на твёрдой фазе, до­бавляют исследуемый антиген и меченый стандартный антиген. Определяют радиоактивность связанного и несвязанного антиге­на и по стандартной калибровочной кривой устанавливают кон­центрацию исследуемого антигена.

РЕАКЦИЯ КОАГГЛЮТИНАЦИИ (РКОА)

Реакция используется в микробиологической практике для индикации и типирования корпускулярных и растворимых анти­генов. Преимущества реакции - специфичность, простота поста­новки, экономичность.

Сущность реакции - белок А, находящийся на поверхности золотистого стафилококка (штамма Cowan 1), селективно реаги­рует с Fc - фрагментом Igl, Ig2, Ig4, в результате чего остаются свободными антидетерминанты антител (Fab - фрагмент), кото­рые взаимодействуют с гомологичными антигенами и вызывают агглютинацию стафилококков. Компоненты реакции:

1. коммерческие стафилококковые реагенты;

2. растворимый антиген или исследуемая культура; Постановка реакции:

Реакция ставится на пластинах или предметных стеклах. К стафилококковому реагенту добавляют 0,1 мл исследуемой куль­туры или растворимого антигена, осуществляют инкубирование при комнатной температуре в течение 10-30 мин. В положитель­ном случае отмечается образование агглютинации в капле.