Лабораторная работа № 6

Тема: Определение концентрации мочевой кислоты в биологических жидкостях энзиматическим колориметрическим методом

Цель: Научиться определять концентрацию мочевой кислоты в сыворотке (плазме) крови и в моче, изучить значение данного показателя для диагностики патологических состояний (подагры).

Принцип метода: Содержащаяся в пробе мочевая кислота окисляется под действием фермента уриказы с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. В присутствии пе5роксидазы перекись водорода окисляет окисляет хромогены с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации мочевой кислоты в пробе.

Мочевая кислота + 2Н₂О₂ + О₂ аллантоин + СО₂ + Н₂О₂

2 Н₂О_{2 +} ДХФС + ААП окрашенный продукт (хинонимин) + 4Н₂О,

где ДХФС – 3,5-дихлоро-2-фенолсульфонат; ААП – 4-аминоантипирин

Ход определения: в пробирки внести реактивы по следующей схеме

Реактивы	Проба	Стандарт	Контроль
Рабочий раствор, мл	2,0	2,0	2,0
Стандартный раствор, мл	–	0,05	–
Сыворотка (плазма) крови или разведенная моча, мл	0,05	–	–

Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют не менее 10 минут при 20-25^о С. Пробы фотометрируют против контроля при длине волны 520 нм (490 нм) в кювете с толщиной поглощающего слоя 0,5 см (1 см). Окраска стабильна не менее 15 минут после окончания инкубации.

Расчет: сыворотка (плазма) крови С_{мочевины} = мкмоль/л

или

С_{мочевины} = мг/100 мл

моча С_{мочевины} = мкмоль/л

или

С_{мочевины} = мг/100 мл, где

Е_оп – оптическая плотность опытной пробы;

Е_ст – оптическая плотность стандартной пробы.

Нормальные показатели:

сыворотка (плазма) крови – женщины 142- 339 мкмоль/л (2,4- 5,7 мг/100 мл

– мужчины 202-416 мкмоль/л (3,4-7,0 мг/100 мл)

моча – 1,49-4,46 мкмоль/24 часа (250-750 мг/24 часа)

Результат анализа:

Вывод:

Лабораторная работа № 7

Тема: Определение содержания билирубина в сыворотке крови

Цель: Научиться определять содержание билирубина в сыворотке крови, изучить значение этого показателя для дифференциальной диагностики патологий (желтух).

Принцип метода: Связанный (прямореагирующий) билирубин непосредственно реагирует с диазотированной сульфаниловой кислотой, а несвязанный – в присутствии кофеинового реактива с образованием окрашенного азобилирубина. Интенсивность окраски раствора пропорциональна содержанию билирубина.

Проведение анализа.

1. Определение коэффициента пересчета к.

В кювету с длиной оптического пути 1 см или 0,5 см внести калибровочный раствор билирубина из флакона и измерить его оптическую плотность (Б) при 540 нм (зелёный светофильтр) относительно дистиллированной воды.

Рассчитать коэффициент пересчета по формуле:

К = С/Е,

где С - концентрация калибровочного раствора билирубина;

Е - оптическая плотность калибровочного раствора билирубина.

2. Ход определения.

В пробирки или кюветы внести реактивы (см. Таблицу), осторожно перемешать и оставить стоять при комнатной температуре. Оптическую плотность (Е) измерить при 540 нм (зелёный светофильтр) в кюветах с длиной оптического пути 0.5 см относительно раствора сравнения: для определения связанного (прямореагирующего) билирубина через 10 мин. после добавления диазореактива, для определения общего билирубина - через 20 мин.

Схема постановки опыта:

Раствор	Общий билирубин	Связанный билирубин	Раствор сравнения
Сыворотка, мл	0,25	0,25	0,25
Кофеиновый реактив, мл	2,0	-	-
Раствор NaCl, мл	-	2,0	2,25
Дназореактив, мл	0,25	0,25	-

Расчет.

Содержание билирубина в исследуемой сыворотке крови рассчитать по формуле:

C = K ·E,

где С - концентрация билирубина, мкмоль/л;

К - коэффициент пересчета (см. п.1);

Е - оптическая плотность раствора с исследуемой сывороткой.