Лабораторная работа № 4

Тема: Количественное определение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови

Цель: Изучить активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови, ее значение для диагностики гепатита.

Принцип метода: Аминотрансферазы или трансаминазы катализируют межмолекулярный перенос аминогруппы с амнокислот на кетокислоты. Коферментом трансаминаз является фосфопиридоксаль, который служит непосредственным переносчиком аминогрупп с аминокислоты на кетокислоту. АлАТ катализирует реакцию переаминирования между аланином и -кетоглутаровой кислотой:

α-кетоглутарат

Аланин

Глутамат

пируват

По количеству образовавшейся пировиноградной кислоты можно судить об активности фермента. Количество пировиноградной кислоты определяется колориметрическим путем по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином, при которой развивается красно-бурое окрашивание:

Пируват

2,4-ДНФГ

2,4-ДНФ-гидразон пирувата

Повышение активности АлАТ наблюдается при заболеваниях печени, а повышение активности АсАТ – при патологии сердечной мышцы.

Активность АлАТ в норме составляет 28 – 190 нмоль/сл

Схема постановки опыта

	Контрольная проба	Опытная проба
Реагент 1 (АлАТ, субстрат), мл	0,25	0,25
Дистиллированная вода, мл	0,05	–
Сыворотка, мл	–	0,05
Перемешать и инкубировать 30 мин
Реагент 2 (динитрофенилгидразин), мл	0,25	0,25
Перемешать и оставить при комнатной температуре на 20 мин
NaOH (С = 0,4 моль/л), мл	2,5	2,5

Перемешать и через 10 минут измерить оптическую плотность пробы против контрольной пробы при длине волны 540 нм, кювета с толщиной слоя 5 мм. Активность АлАТ в опытной пробе определить по калибровочному графику в нмоль/сл.

Лабораторная работа № 5

Тема: Определение мочевины в сыворотке крови и в моче по цветной реакции с диацетилмонооксимом

Цель: научиться определять содержание мочевины в сыворотке крови и моче, изучить значение данного показателя для диагностики патологий.

Принцип метода: мочевина образует окрашенный продукт при взаимодействии с диацетилмонооксимом, интенсивность окраски определяется фотоколориметрически и пропорциональна концентрации мочевины в пробе.

Ход определения: в пробирки внести реактивы по следующей схеме:

	Холостая проба, мл	Калибровочная проба (Dk), мл	Опытная проба (Do), мл
Образец	-	-	0,01
Калибровочный раствор мочевины	-	0,01	-
Рабочий раствор	2,00	2,00	2,00

Содержимое пробирок тщательно перемешивают, отверстие закрывают алюминиевой фольгой и пробирки помещают точно на 10 минут в кипящую водяную баню. Затем пробирки быстро охлаждают в потоке холодной воды и измеряют оптическую плотность при 510 нм (490 – 540 нм, зеленый светофильтр) против холостой пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 1,0 или 0,5 см. Параллельно обрабатывают калибровочный раствор. Окраска устойчива в течение 15 минут.

Расчет содержания мочевины производят по формуле:

С = ;

где С – содержание мочевины в опытной пробе, ммоль/л;

D_o – оптическая плотность опытной пробы;

D_к – оптическая плотность калибровочной пробы;

8,0 – содержание5 мочевины в калибровочном растворе, ммоль/л

Нормальные показатели концентрации мочевины:

• в сыворотке (плазме) крови 2,5 – 8,3 ммоль/л

• в моче 333 – 583 ммоль/сут

Результат анализа: