Лабораторная работа 7

Тема: Определение глюкозы в биологических жидкостях глюкозооксидазным способом

Цель: Определить содержание глюкозы в сыворотке крови глюкозооксидазным методом.

Принцип метода: Определение глюкозы основано на реакции, катализируемой глюкозооксидазой:

глюкозооксидаза

Глюкоза +O₂−−−−−−−−−−−→ глюколактон + H₂О₂

Образующаяся в ходе данной реакции перекись водорода вызывает окисление субстратов пероксидазы с образованием окрашенного продукта.

Ход работы: В 2 пробирки вносят по 2 мл рабочего реактива (фосфатный буфер, субстраты пероксидазы + глюкозооксидазы в отношении 40:1). В одну из пробирок вносят 0,05 мл стандартного раствора глюкозы концентрации 10 ммоль/л. В другую - 0,05 мл сыворотки крови. Растворы встряхивают и инкубируют при комнатной температуре 20 минут.

После инкубации измеряют оптическую плотность растворов на ФЭК при длине волны X = 490 нм. Кювета с длиной оптического пути, равной L = 5 мм. Раствор сравнения - рабочий реактив.

Расчет концентрации глюкозы:

где Е_о - оптическая плотность в образцах сыворотки;

Е_ст - оптическая плотность стандартного раствора глюкозы.

Вывод:

Лабораторная работа 8

Тема: Определение активности панкреатической липазы

Цель: Исследовать условия действия липазы поджелудочной железы.

Принцип метода: Липаза- малоспецифический фермент, который действует на многие жиры при рН 9,0. Липаза гидролитически расщепляет пищевые жиры и в первую очередь эфирную связь в α-положении. Скорость действия липазы в отдельных порциях жира молока можно узнать по количеству жирных кислот, образующихся при гидролизе жира за определённый промежуток времени. Количество жирных кислот определяют титрованием щелочью в присутствии фенолфталеина

Схема постановки опыта: В колбу для титрования отбирают 1 мл молока (разведенного 1:10), добавляют 1 каплю раствора фенолфталеина и титруют 0,01 Н, NаОН до слабо-розового окрашивания. При первом титровании нейтрализуются органические кислоты - молочная и другие, которые присутствуют в молоке до начала действия липазы (V₀ при t=0 мин.).

Готовят две пробирки с образцами 1 и 2:

Компонент инкубационной смеси	Образец 1	Образец 2
Молоко (разведённое 1:10), мл	10	10
Панкреатическая липаза, мл	1	1
Желчь, мл	-	1

Приготовленные инкубационные смеси тщательно перемешивают.

Смесь в колбах помещают в термостат, температура которого 38-40° С, и через определённые интервалы времени отбирают из каждой пробирки / не вынимая их из термостата /по 1 мл смеси и титруют 0,01 моль/л NaOН /Vi/.

Данные фиксируют в таблице:

t, мин. Vi 0,01н NaOH, мл	0	10	20	30	40	50
Опытная проба без желчи
Опытная проба с желчью

На основании полученных данных строят график, где

V= Vi, мл - активность липазы, выраженная объёмом гидроксида натрия, пошедшего на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся за данный отрезок времени.

Выводы: (сравнить активность панкреатической липазы)