Лабораторная работа 6

Тема: Окислительное декарбоксилирование ПВК. Цикл трикарбоновых кислот

Цель: 1. Доказать, что в цикле трикарбоновых кислот идет окисление ацетил - КоА.

2. Убедиться что ацетил - КоА в ЦКТ окисляется до конечных продуктов СО₂ и Н₂О.

Приготовление тканевого гомогената

Взвесить 1 г ткани, измельчить ткань, добавить щепотку растертого стекла, тщательно растереть в ступке, добавить 5 мл воды, тщательно растереть, добавить еще 15 мл воды, снова растереть всю смесь. Отфильтровать через марлю (или отцентрифугировать). Полученный гомогенат из марли перенести в пробирку, добавить 5 мл воды и использовать для опытов 1,2,3.

1. Изучение функционирования цтк по убыли ацетил КоА

Принцип: Первым этапом ЦКТ является реакция кондексации ацетил - КоА со ЩУК, которая осуществляется цитратсинтетазой. Образовавшаяся лимонная кислота подвергается превращению в ЦТК, а освободившийся КоА - SН можно определить, используя реактив Фолина (появляется синее окрашивание). Если блокировать ЦТК малоновой кислотой, то ацетил - КоА не используется и КоА - SН не образуется.

Схема постановки опыта:

Содержимое пробирки	Контроль	Опыт
Фосфатный буфер рН = 7,4, мл	2,0	2,0
Раствор ацетил – КоА, мл	0,5	0,5
Раствор щавелевоуксусной кислоты, 1%, мл	0,5	0,5
Раствор малоновой кислоты, мл	1,0	-
Инкубационная смесь №1, мл	-	1,0
Суспензия митохондрий, мл	0,5	0,5
Инкубация 10 минут при комнатной температуре
Реактив Фолина А и Б	0,5	0,5
	0,5	0,5

Результаты (окраска раствора).

Выводы:

2. Изучение функционирования цтк по образованию со2

Принцип: При окислении ацетил - КоА в цикле трикарбоновых кислот образуется СО₂, который связывается Са(ОН)₂ и определяется при добавлении Н₂SО₄ по выделению пузырьков газа.

Схема постановки опыта:

Содержимое пробирки	Контроль	Опыт
Фосфатный буфер рН = 7,4, мл	2,0	2,0
Раствор ацетил – КоА, мл	0,5	0,5
Раствор щавелевоуксусной кислоты, 1%, мл	0,5	0,5
Раствор малоновой кислоты, мл	1,0	-
Инкубационная смесь №2, мл	-	1,0
Раствор Ca(ОН)2, мл	1,0	1,0
Суспензия митохондрий, мл	0,5	0,5
Инкубация 10 минут при комнатной температуре
0,1н раствор Н2SО4, мл	1,0	1,0

Результаты (выделение СO₂)

Выводы:

3. Изучение функционирования цтк по образованию атомов водорода

Принцип: При окислении ацетил - КоА в цикле трикарбоновых кислот образуется 8 атомов водорода, которые отщепляются при участии соответствующих дегидрогеназ. В качестве акцептора используется 2,6-ДХФИ. Если цикл функционирует, то 2,6 - ДХФИ восстанавливается и обесцвечивается.

Схема постановки опыта:

Содержимое пробирки	Контроль	Опыт
Фосфатный буфер рН = 7,4, мл	2,0	2,0
Раствор ацетил – КоА, мл	-	0,5
Раствор щавелевоуксусной кислоты, 20%, мл	-	0,5
Дистиллированная вода, мл	1,0	-
Суспензия митохондрий, мл	1,0	1,0
0,001н раствор дихлорфенолиндофенола, мл	2-3 капли	2-3 капли
Инкубация 15-20 минут при комнатной температуре

Результаты (окраска растворов)

Выводы: