9.7. Метод фракционирования липопротеидов

в полиакриламидном геле

Принцип метода основан на том, липопротеиды в зависимости от количественного содержания в них белков имеют различную электрофоретическую подвижность.

Липопротеиды (ЛП) плазмы крови являются транспортной формой липидов в организме человека. Они транспортируют экзогенные и эндогенные липиды. Отдельные ЛП осуществляют захват избыточного ХС из стенок периферических тканей и его обратный транспорт в желчные кислоты и выведения с желчью. ЛП – это высокомолекулярные водорастворимые частицы, комплекс белков и липидов, соединенных нековалентными связями.

ХМ – самые богатые ТГ частицы, содержат до 90 % эндогенных ТГ. Образуются в стенке кишечника в результате всасывания липидов. В норме из крови исчезают через 8 – 12 часов после приема пищи. ХМ поступают в кровь через лимфатические сосуды. Основная их функция - транспорт поступивших с пищей липидов. ХМ содержат мало 1 – 2 % белка, в основном апо - А и апо - С, много ТГ – 90 %, ФЛ – 6 %, ХС – 2 %.

ЛПОНП – это широкий спектр частиц различающихся размерами. Они содержат: белка – до 6 - 10 %, это апо - В, апо - С, апо – Е; ФЛ до 15 – 21 %, ХС до 8 %, ТГ до 56 %.

ЛПНП – самые богатые ХС частицы. Содержание ХС в них почти 50 %, ФЛ – 20 %, ТГ – 10 % , в их состав входят белки апо - В, апо – С, апо - Д, апо - Е, апо -А, апо - F.

ЛПВП – богаты белками, в основном апо - А 1, апо - А II, апо - С. Эти частицы после возникновения в гепатоцитах имеют дисковидную форму, снаружи покрыты апо белками, внутри двойной слой ФЛ. Вид и размер частиц зависит от количества молекул апо - А 1 на их поверхности. Во время нахождения в кровотоке эти частицы накапливают внутри себя ХС. Апо - А 1 активирует сывороточный фермент ЛХАТ – лецитин холестерин ацетил трансферразу, которая катализирует расщепление ФЛ и ацетилируя ХС, переводит ХС в биологически неактивную форму. Количество ХС может достигать до 33 % от количества ФЛ. В этой форме ЛПВП переносят ХС в печень, оттуда он выводится из организма.

Помимо этих классов ЛП выделяют еще ЛППП (промежуточной) плотности, они образуются в плазме крови в качестве промежуточных комплексов на пути превращения ЛПОНП в ЛПНП. ЛППП – относительно богаты не только ХС, но и ТГ.

Предварительно окрашенные липопротеиды сыворотки крови подвергают электрофорезу в направлении сверху вниз в колонке, заполненной слоями полиакриламидного геля (ПААГ). Нижний слой геля самый мелкопористый, верхний самый крупнопористый. Липопротеиды в зависимости от размера их молекул задерживаются в разных участках геля.

Реактивы:

1. ТРИС (оксиметил) аминометан.

2. Акриламид.

3. Метиленбисакриламид.

4. ТЕМЕД.

5. Рибофлавин.

6. Сахароза.

7. Глицин.

8. Судан черный – насыщенный спиртовый раствор.

9. Аммония персульфат. 0,14 % раствор.

10 Электродный трисглициновый буфер, рН 8,3: в 1 л воды растворяют 0,6 г ТРИС и 2, 88 г глицина; с помощью HCI или едкого натра устанавливают рН .

11. Трис- буфер рН 8,9 – раствор А: к 36,6 г ТРИС добавляют около 40 мл воды, 48 мл 1 н. HCI и 0,23 мл ТЕМЕД; после растворения объем доводят до 100 мл водой и устанавливают рН 8,9.

12. Трис – буфер рН 6,7, раствор В: к 5,98 г ТРИС добавляют около 40 мл воды, 48 мл 1 Н НCI и 0, 46 мл ТЕМЕД, доводят объем до 100 мл и устанавливают рН 6,7

13. 28% раствор акриламида – реактив С: 28 г акриламида и 0,735 г метиленбисакриламида растворяют в воде и доводят объем до 100 мл.

14. 10% раствор акриламида – реактив Д: 10 г акриламида и 2, 5 г метиленбисакриламида растворяют в воде и объем доводят до 100 мл.

15. Раствор рибофлавина – реактив Е : 4 мг рибофлавина растворяют в 100 мл воды.

16. 40% раствор сахарозы – реактив F: 40 г сахарозы растворяют в воде и доводят объем до 100 мл.

Ход определения:

Определение проводят в аппарате для вертикального электрофореза. Формируют столбики четырехслойного геля:

нижний 10% гель: раствор А – 1 мл, В - 0 мл, С- 2,8 мл, аммония персульфат – 4 мл, воды – 0, 2 мл;

второй снизу 5% гель : раствор А - 1 мл, раствор С – 1,36 мл, аммония персульфат – 4 мл, воды – 1,64 мл;

третий снизу 3% гель : раствор А - 1 мл, раствор Д – 2 мл, раствор Е – 1 мл, раствор F – 4 мл,

верхний 3% гель : раствор В – 1 мл, раствор Д - 2 мл, раствор Е - 1 мл, раствор F – 4 мл.

После того как залит очередной раствор, на него сверху наносят несколько капель воды, под слоем которого гель полимеризуется.

Ход определения:

К 0,3 мл исследуемой сыворотки добавляют 0,15 мл раствора судана черного, 0,15 мл раствора сахарозы и 0,05 мл трис - буфера рН 6,7, после чего перемешивают и оставляют на 1 час. Затем 0,03 – 0,05 мл этой смеси осторожно наносят на поверхность сформированного геля, дают впитаться в течение нескольких минут и проводят электрофорез в течение 1 ч. При силе тока 4 – 5 мА на трубку. Получают липидограмму, в которой липопротеиды располагаются в следующем порядке (сверху вниз):

ХМ

пре в – ЛП или ЛПОНП,

в - ЛП или ЛПНП,

а - ЛП или ЛПВП,

Процентное распределене липидов между основными классами липопротеидов падает в зависимости от содержания в сыворотке крови холестерина, триглицеридов, фосфолипидов (рис. 28).

Рис. 28. Типы липидограмм сыворотки крови человека