2.2. Абсорбционная и дифференциальная спектрофотометрия белков.

Спектр поглощения белка в УФ-области (230—310 нм) определяется поглощением ароматических аминокислот: триптофана, тирозина и фенилаланина. УФ-свет поглощают хромофор­ные группы этих аминокислот: индольное кольцо триптофана, фенольное кольцо тирозина и бензольное кольцо фенилаланина.

Основным законом абсорбционной спектрофотометрии является закон Ламберта-Бэра:

I=I₀e^-lc, (1)

где I  интенсивность света, прошедшего через раствор концентрацией с (моль л^-1); I₀ — интенсивность света, падающего на кювету; l – толщина кюветы;  – молярный коэффициент экстинкции (моль^-1 х м^-1).

Закон Ламберта—Бэра в логарифмической форме запишется следующим образом:

D=lc, (2)

где D—оптическая плотность раствора.

Зависимость D или  от длины волны поглощенного света назы­вается спектром поглощения: D=(). Спектральные приборы, которые измеряют спектры поглощения или пропускания вещества, называются спектрофотометрами. На рис.2 изображена блок-схема двухлучевого спектрофотометра.

Спектр поглощения триптофана (рис.1а) имеет максимум поглощения _max= 280 нм и небольшой пик 288 нм. Молярный коэффициент экстинкции ₂₈₀=5,610⁵ моль^-1м^-1. Максимум спе­ктра поглощения тирозина _max= 275 нм и ₂₇₅= 1,2510⁵ моль^-1м^-1. Наиболее слабое поглощение имеет фенилаланин: _max = 257.5 нм и _257.5=0,1910⁵ моль^-1м^-1. Таким образом, харак­терная полоса поглощения белка с _max = 280 им представляет в основном сложение спектров поглощения триптофановых и тирозиновых остатков.

При конформационных перестройках белковых молекул про­исходит небольшое смещение спектра (меньше 1,0 нм), которое трудно регистрировать на спектрофотометрах. Для повышения чувствительности метода используется дифференциальная спектро-фотометрия. Под дифференциальным спектром понимают разно­стный спектр, получаемый при автоматическом вычитании из спектра поглощения вещества в измеряемой кювете спектра погло­щения вещества в кювете сравнения.Если спектр поглощения в кювете сравнения D(), а при действии определенного фактора в измеряемой кювете наблюдается смещенный на  спектр D(+), тогда дифференциальный cпектр будет:

Рис.1. Спектр поглощения (а) и темиературно-пертурбационный дифферен­циальный спектр (б) триптофана в воде ;(рН == 7,0):

градиент температуры =10; D – дифференциальная оптическая плотность.

D() = D(+) – D() (3)

Если разложить (4.11) в степенной ряд по малому параметру  и пренебречь членами второго порядка малости, тогда

(4)

В первом приближении дифференциальный спектр соответствует первой производной от спектра поглощения. Таким образом, вместо регистрации небольших спектральных сдвигов  точно измеряют интенсивность дифференциального поглощения D на чувствительных дифференциальных спектрофотометрах.Методы абсорбционной и дифференциальной спектрофотометрии широко используются для определения различных констант равновесия диссоциации низкомолекулярных лигандов, констант скорости ассоциации субъединиц в белках, конформационных изменений в белках, включая процессы денатурации и ренатурации белков (см. рис. 4). Конформациониое состояние белковой глобулы оце­нивается определением доступности хромофорных групп (триптофанилов и тирозинов) для внешних пертурбантов.