Генная инженерия

Генная инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

1. Специфическое расщепление ДНК рестриктазами.

2. Секвенирование нуклеотидов.

3. Конструирование рекомбинантной ДНК:

4. Клонирование (размножение) рекомбинантной ДНК:

В 1985 году К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР). К анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке 2 синтетических праймера. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК. Амплификация заключается в повторяющихся циклах, представляющих собой трехступенчатый процесс: I - денатурация ДНК при 95°С; II - отжиг праймеров с комплементарными последовательностями (40-60°С); III - последующая достройка полинуклеотидных цепей от праймеров с помощью ДНК-полимеразы при температуре 70-75°С.

Продолжительность одного цикла менее 3 мин. Таким образом, за 2 ч можно получить около миллиарда копий определяемой последовательности ДНК. Автоматизированная процедура, состоящая из 30 и более циклов, занимает 3—4 часа. Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования. ПЦР иногда называют бесклеточным молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning).

Применение ПЦР. С использованием ПЦР разработаны новые диагностические тесты на генетические и инфекционные заболевания. Метод используют для ранней диагностики наличия в организме вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Метод анализа индивидуальных сперматозоидов сразу нашел практическое применение в судебной медицине. С помощью ПЦР удалось амплифицировать и клонировать фрагменты митохондриальной ДНК из ископаемых останков мозга человека возраста 7 тысяч лет!

5. Введение гена в клетку. Используют 2 способа.

- Трансдукция.

Вектор - молекула ДНК или РНК, состоящая из двух компонентов: векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Типы векторов:

Бактериальные плазмиды. Одна их наиболее часто употребляемых - pBR 322 создана на основе плазмид, выделенных из E. coli.

Вирусы. Есть вирусы, которые не ведут к гибели клетки, но встраиваются в геном клетки-хозяина и размножаются вместе с ней, либо вызывают ее неконтролируемый рост, т.е. превращают в раковую.

- прямое введение гена в клетку – трансформация. Ее виды:

Трансфекция. ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза.

Микроинъекция ДНК с помощью микропипеток диаметром 0.1-0.5 микрона и микроманипулятора.

Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран.

Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз.

Метод биологической баллистики (биолистики) является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации растений. На мельчайшие частички вольфрама напыляется ДНК вектора. Они помещаются внутрь биолистической пушки, откуда с огромной скоростью выбрасываются и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.

С развитием генной инженерии появилась возможность заставить микроорганизмы синтезировать вещества, которые получить другими методами сложно - интерферон, инсулин, соматостатин, соматотропин, фермент урокиназу, некоторые факторы свертывания крови и др. Все эти белки применяются для лечения болезней.