4. Ионообменная хроматография.
В основе метода лежит ионная адсорбция, протекающая между ионами адсорбента и ионами электролита.
В качестве адсорбентов используют ионообменные сорбенты или иониты. Иониты – не растворимые, твердые вещества, содержащие в своем составе функциональные группы, ионы которых способны обмениваться на ионы, находящиеся в растворе. Иониты, обменивающие свои катионы на
катионы электролита, называют катионитами; иониты, обменивающие анионы, называют анионитами.
Процесс ионного обмена можно выразить схемами:
Катионный обмен
RAn-H+ + Na+ + Cl- ↔ RAn-Na + + H+ + Cl-
Анионный обмен
RKt+OH- + Na+ + Cl- ↔ RKt+ Cl- + Na+ + OH-
Здесь R – полимерный радикал, образующий каркас ионита.
Ионный обмен сопровождается изменением реакции среды: в случае катионного обмена среда становится кислой, в случае анионного обмена – щелочной.
Иониты применяются в качественном анализе для разделения катионов и анионов. В клинической диагностике – в аминокислотных анализаторах для определения отдельных аминокислот.
5. Распределительная хроматография.
Основана на различии растворимости разделяемых веществ в двух несмешивающихся фазах . Для осуществления ее необходима система, состоящая из неподвижной фазы (носителя) и подвижной фазы (растворителя).
На неподвижную фазу наносят смесь веществ, и через нее пропускается ток растворителя. Чем лучше данное вещество растворимо в подвижной фазе, тем дальше оно продвинется по направлению тока растворителя по неподвижной фазе. Менее растворимые вещества распределяются ближе к точке нанесения.
Различают следующие виды распределительной хроматографии:
колоночную;
бумажную (лист специальной хроматографической бумаги, изготовленной из чистой целлюлозы, рассматривают как сплюснутую колонку);
тонкослойную – на тонком слое адсорбента (силикагеля, оксида алюминия, ионообменных смол);
газовую, газо-жидкостную.
Например, в методе тонкослойной хроматографии (ТСХ) неподвижная твердая фаза (сорбент) наносится тонким слоем на пластинку из стекла, алюминиевой фольги или полиэфирной пленки. Пробу анализируемой жидкости микропипеткой или микрошприцом наносят в виде пятна или полосы на стартовую линию в 2-3 см от края пластинки.
Край пластинки погружают в растворитель, который действует как подвижная фаза. Под действием капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их разделению.
6. Молекулярно-ситовая хроматография.
Основана на разделении смеси веществ в зависимости от размеров молекул. Ее называют также гель-фильтрацией или гель-хрматографией.
В качестве носителей используются различные гели (гель – дисперсная система, в которой частички твердого вещества связаны между собой молекулярными силами сцепления) с трехмерной сетчатой структурой – декстрановые (сефадекс), агарозные (сефароза), простые селикагели, а также стеклянные гранулы. Все гели и стекла должны иметь поры строго определенного размера и не взаимодействовать с анализируемым веществом.
Молекулярно-ситовая хроматография может быть выполнена в колоночном и тонкослойном вариантах. Преимущество отдают колоночному варианту.
Если набухшие гранулы геля поместиь вместе с растворителем в вертикальную колонку и внести на поверхность смесь веществ, то разделение смеси веществ происходит за счет того, что в поры геля могут проникать вещества, размеры молекул которых не превышают размеров пор. В результате проникновения внутрь пор геля молекулы меньшего размера элюируются с геля позже, чем более крупные молекулы, не проникающие в поры геля.
Декстрановые и полиакриламидные (биогель Р) гели широко используются для освобождения органических веществ от ионов неорганических солей, например, для обессоливания белков. Высокомолекулярные вещества (ВМВ) – белки не проникают в поры мелкопористых сефадексов, а неорганические соли, наоборот проникают. При добавлении в колонку растворителя белки выходят из нее первыми, а соли – значительно позже.