Тема 3. Биохимические методы исследования мяса при его контаминации гнилостной микрофлорой.

Бактериологическое исследование мяса для определения микробов из группы гнилостных микроорганизмов — процесс длительный и сложный. Хранение туш в течение нескольких дней на небольших боенских предприятиях или лаборатория ВСЭ рынков, где нет холодильных складов, может привести к порче мяса. Для более быстрого определения обсемененности мяса токсигенными микроорганизмами используют цветную окислительную и трифенилтетразольные реакции.

Цветная окислительная реакция. В вытяжках из мяса, в котором имеются токсигенные или большое количество гнилостных микроорганизмов, содержится много легко окисляющихся веществ. В вытяжках из мяса, необсемененного микробами, таких веществ значительно меньше.

Мясные вытяжки после добавления к ним окислительно-восстановительного индикатора окрашиваются в присущий ему цвет (синий, зеленый). Если к мясной вытяжке прилить затем в определенном объеме раствор марганцовокислого калия, то при незначительном содержании окисляющихся веществ индикатор быстро обесцветится (восстановится) и вытяжка приобретет цвет марганцовокислого калия. При содержании в вытяжках большого количества легко окисляющихся веществ, они свяжут такой же объем КМп04, вследствие чего цвет индикатора сохранится. Объясняется это тем, что легко окисляющиеся вещества тормозят восстановление окислительно-восстановительного индикатора.

Приготовление вытяжки предусматривает извлечение из мяса токсических веществ микроорганизмов и освобождение ее от белков. Помимо индикатора и марганцовокислого калия, к вытяжкам добавляют раствор азотнокислого серебра и соляной кислоты. Азотнокислое серебро переводит токсины в окисленную (лабильную) форму, соляная кислота создает резко кислую среду, необходимую для быстрого течения окислительной реакции. Цветная окислительная реакция будет положительной при наличии в мясе сальмонелл, кишечной палочки, протеуса или других грамотрицательных токсигенных микроорганизмов, а также при содержании в нем большого количества гнилостных микробов. С вытяжками из мяса свиней, больных рожей, цветная окислительная реакция отрицательна. Такой же результат получается и при выделении из мяса нетоксигенных (сапрофитных) микроорганизмов. Показания цветной окислительной ре-акции с пробами обсемененного мяса зависят от способности микробов к токсинообразованию.

Данную реакцию можно ставить с мясом млекопитающих, птиц и рыб, а также солониной. На ее показания влияют некоторые факторы. Так, реакцию нельзя ставить с вытяжками из мяса, полученного в первые часы после убоя животного. Не показательна она и для оттаянного мяса. В вытяжках из такого мяса, вследствие пониженного содержания в нем воды, будет больше окисляющихся веществ, чем в остывшем мясе.

Ход реакции. В пробирку наливают 2 мл вытяжки из исследуемой пробы и добавляют в нее реактивы в такой последовательности: одну каплю 1 %-ного спиртового раствора крезилблау, три капли 0,5%-ного раствора азотнокислого серебра и одну каплю 40%-ной соляной кислоты (вытяжку готовят так же, как и для формольной реакции, см. стр. 45). После этого пробирку сильно встряхивают, добавляют из микропипетки 0,15 мл 1 %-ного раствора марганцовокислого калия и снова встряхивают. В другую пробирку для контроля берут 2 мл физиологического раствора или 2 мл вытяжки из мяса заведомо здорового животного и добавляют реактивы в тех же количествах и в той же последовательности. Реакцию читают дважды на белом фоне: сразу же после ее постановки и через 10—15 минут; второй результат считается окончательным.

При наличии микробов или их токсинов в исследуемой пробе цвет вытяжки остается синим или зеленым; при отсутствии микробных токсинов вытяжка окрашивается в розово-красный или красно-бурый цвет.

Если в мясе содержится незначительное количество микробных токсинов, то вытяжка становится фиолетовой, а иногда даже и обесцвечивается, но через 10—15 минут цвет ее снова восстанавливается.

Цветная реакция на микробные токсины с индикаторами типа оксазинов-тиазинов. К этой группе индикаторов относят краски бриллиант крезилблау, толуидин, азур метиленовый голубой, метиленовый голубой.

Техника постановки реакции такая же, как и с крезилблау, но вместо этой краски добавляют одну каплю какого-либо другого индикатора. Все индикаторы растворяются в 95%-ном спирте. Для приготовления 0,1 %-ного раствора метиленового голубого разводят 1%-ный спиртовой раствор этой краски водой в 10 раз. Оценка реакции с этими индикаторами по изменению цвета вытяжек приведена в таблице.

Цветная окислительная реакция с флюрохромными индикаторами. Реакцию ставят по описанной выше методике, но вместо 1%-ного спиртового раствора крезилблау добавляют две капли 0,1%-ных спиртовых растворов какого-либо из следующих флюрохромных индикаторов: флюоресцеин, флюоресцеино-натриевая соль, аурамин, люминол. Реакцию читают при дневном свете и в потоке ультрафиолетовых лучей. Люминесцентный анализ вытяжек после добавления флюрохромов позволяет более четко оценить показания реакции .

Определение в мясе грамотрицательной микрофлоры по реакции с трифенилтетразолиумом хлористым. Под воздействием восстановителей — ферментов (дегидразы) грамотрицательных бактерий трифенилтетразолиум хлористый переходит в красный трифенилформазан. Эмульсия из мяса, в котором присутствуют бактерии из группы возбудителей пищевых токсикоинфекций, окрашивается в красный цвет. Грамположительные бактерии не содержат дегидраз, поэтому мясные вытяжки, где нет грамотрицательных бактерий, остаются бесцветными.

Ход определения. В сосуд гомогенизатора помещают 0,5 г мяса, приливают 5 мл физиологического раствора и приготовляют мясную эмульсию (привращении ножа со скоростью 50 оборотов в секунду). Затем ее переносят в пробирку и добавляют 0,25 мл 1 %-ного водного раствора трифенилтетразолиума хлористого. Смесь взбалтывают и ставят в термостат или в водяную баню с температурой воды 37°. Наблюдение за ходом реакции проводят через каждый час и заканчивают через 3 часа. Если в мясе имеется грамотрицательная микрофлора, мясная эмульсия окрашивается в красный цвет. Появление такого цвета в первые 1/2 часа говорит об обсеменении мяса бактериями протеус вульгарис. Если через 3 часа цвет эмульсии не изменится, в мясе грамотрицательных микроорганизмов нет.

Дифференциация бактерий из группы возбудителей пищевых токсикоинфекций в мясе трифенилтетразольными реакциями. Для дифференциации грамотрицательных бактерий в мясе ставят трифенилтетразольные реакции, одновременно добавляя к мясным эмульсиям различные сахара или некоторые другие компоненты. Если в эмульсии есть сахар, который усваивается бактериями, происходит активное их размножение; ферментативная активность бактерий повышается, и реакция становится резко положительной. При значительной концентрации сахара, который не сбраживается под воздействием ферментов бактерий, в среде повышается осмотическое давление. В этом случае рост бактерий, а также ферментативная активность их задерживаются (иногда отмечают частичное отмирание бактерий), и реакция с трифенилтетразолом будет слабо выражена или отрицательна.

Ход определения. Образцы мяса, в которых обнаруживают грамотрицательную микрофлору, подвергают дальнейшему исследованию для определения вида бактерий. Для этого в гомогенезаторе готовят мясную эмульсию (3,5 г мяса на 35 мл физиологического раствора), разливают ее в семь пробирок по 5 мл и в каждую вносят по 0,25 мл 1 %-ного раствора трифенилтетразолиума хлористого. Затем в первые пять пробирок добавляют- по 0,5—0,6 г следующих Сахаров или многоатомных спиртов: в первую — лактозу, во вторую — глюкозу, в третью—сахарозу, в четвертую — маннит, в пятую — арабинозу, в шестую — раствор бриллиантгрюн для создания концентрации 1 : 300 000 (приливают 0,5 мл раствора бриллиантгрюн в разведении 1 : 30 000. Все пробирки ставят в термостат или в водяную баню с температурой воды 37°. Учитывают реакции через 3 часа .

Бактерии кишечных и протеусных групп различают последующим признакам: 1) кишечная палочка восстанавливает тетразол в эмульсии с бриллиантгрюн, протеус не восстанавливает.

таблица