Сучасні методи аналізу

Перші методики скринінгу і доказів для допінг-контролю, які отримали широке розповсюдження, полягали в приготуванні зразків препаратів з використанням рідинної екстракції сечі, концентрації отриманих екстрактів і розділення речовин, що аналізуються за допомогою газорідинної хроматографії (ГРХ) і тонкошарової хроматографії (ТШХ). Для аналізу продуктів, розділених з допомогою ГРХ використовували плазмено-іонізаційний детектор (ПІД), який дозволяв виявити присутність стимуляторів із групи амфетаміну за сигналом з часом утримання, що порівнювали зі стандартними зразками аналогічних препаратів. ТШХ використовували для ідентифікації стрихніну і таких стимуляторів з гілроксильованим кінцем, як β-гідроксиаміфетин і фенілефрин. У випадках з позитивними результатами тесту додаткову інформацію отримували за допомогою дериватизації, мікроінфрачервоної спектроскопії, а також масс-спектроскопії (МС).

Удосконалення аналітичних методів і поява різних технічних новинок призвело до розробки складних процедур приготування зразків і появи різноманітних видів аналізу і, на кінець, до створення і випуску в продажу спеціального обладнання, що в цілому, дозволяє проводити обширний аналіз зразків, зокрема сечі, елітних спортсменів з метою допінг-контролю. Залежно від властивостей речовин, що аналізуються, використовуються різні аналітичні інструменти. Сучасні хроматографічні системи базуються на використанні капілярної газової хроматографії або високоефективної рідинної хроматографії.

Газова хроматографія. Сьогодні капілярні колонки представляють собою найбільш розповсюджений засіб для проведення газової хроматографії (ГХ) з метою допінг-контролю. Висока ефективність методу забезпечує широкий вибір для створення різних методик і можливостей з метою вирішення таких завдань, як проведення повного аналізу або скринінгу специфічних речовин.

Рідинна хроматографія. Порівняно з газовою рідинна хроматографія (РХ) виокремлюється значним різномаїттям розмірів, наповнювачів і, оскільки, розділення відбувається за умови переносу в рідкому носії, великим набором розчинників і буферів. На відміну від ГХ, РХ має декілька механізмів розділення (нормально-фазова, повернено-фазова, іонообмінна і ситова), чим забезпечується її висока ефективність під час проведення аналізу з метою допінг-контролю.

Імуноафінна хроматографія (ІАХ). В якості засобу виділення речовин що підлягають аналізу, із біологічних проб стали використовувати ІАХ відносно недавно. Суть методу полягає в тому, що моно- або поліклональні антитіла, здатні утворювати нековалентний зв‘язок з різними частинами молекул, що аналізуються, пришивають до носія, наприклад, до сферичних часточок агарози. Гелем, приготовленим з таких часточок, заповнюють колонку з пористим фільтром на одному кінці і пропускають через неї проби сечі або плазми. Під час пропускання через колонку шуканих речовин антитіла, зв‘язані з носієм, пізнають їх і зв‘язують, формуючи нековалентні комплекси, тоді як решта молекул, не здатних взаємодіяти з антитілами, елюруються з розчинником. Зміна умов елюрування дозволяє зруйнувати комплекс речовина-антитіло, не руйнуючи при цьому самих молекул, і отримати шукану речовину в очищеному вигляді, практично без сторонніх домішок, для проведення подальшого аналізу з допомогою ГХ-МС.

Детектори. Детекція та ідентифікація розділених хроматографією речовин в допінг-контролі має надзвичайно велике значення. На сьогоднішній день розроблено багато різних систем детекції, зокрема полум‘яно-іонізуючий детектор, азотно-фосфорний детектор, УФ фотометричний детектор, а також мас-спектрометричні детектори. На прикладі полум‘яно-іонізуючого детектора, який дуже давно широко використовується з ГХ, пояснено принцип роботи. Газ, що виходить з хроматографічної колонки, змішується з повітрям, насиченим воднем, і спалахує за допомогою електропідпалу. Під час згоряння водню в повітрі утворюється невелика кількість іонів, однак за умови піролізу в полум‘ї водню більшість органічних сполук дає значну кількість іонів і електронів і це призводить до збільшення провідності. На так званий колектор або збірний електрод подається напруга, під впливом якої виникає електричний струм, величина якого пропорційна кількості зразку, що згорів після виходу із хроматографічної колонки. Струм реєструється з допомогою амперметра, перетворюється в електричний сигнал і відображається у вигляді піку на хроматограмі.

Якісний аналіз під час проведення допінг-контролю. Для більшості заборонених субстанцій в професійному спорті для позитивного результату тесту достатньо просто отримати підтвердження їх присутності у зразку сечі. Оскільки багато методів скринінгу і отримання доказів ґрунтуються на використанні хроматографії в поєднанні з мас-спектроскопією, були розроблені рекомендації для ідентифікації сполук з допомогою систем ГХ-МС і РХ-МС (/МС).

Присутність речовин вважається підтвердженою, якщо за відносною представленістю відповідної кількості характерних іонів (залежно від використаної мас-спектрометрії) зразок, порівняному з урахуванням допустимих відхилень, відповідним аналогічним зразком стандарту, підданому аналогічному аналізу.

Крім того, час утримання речовин зразку сечі спортсмена не повинен відрізнятися ( в межах допустимого інтервалу відхилення) від контрольного зразку сечі, що містить шукану речовину. Через це для характеристики та ідентифікації речовин в таких складних для аналізу зразках, як проба сечі, суттєве значення має інформація про хроматографічні і, особливо, мас-спектрометричні параметри досліджуваних хімічних сполук. До теперішнього часу проведені численні дослідження мас-спектрометричних характеристик стимулюючих і маскуючих препаратів, а також розроблені методи їх детекції з метою проведення допінг-контролю. Розглянемо загальні принципи проведення аналізу деяких із цих речовин.

Анаболічні стероїди. Розглядаючи статистичні дані відносно результатів проведених тестів на допінг і класів виявлених заборонених речовин, можна помітити, що найчастіше в якості допінгу в спорті використовують анаболічні стероїди. Одним з представників цієї групи є метилтестостерон – похідне тестостерону, отримане шляхом заміни метильною групою залишку водню.

Анаболічні стероїди переважно активно залучаються в метаболічні процеси, утворюючи серію метаболітів, наприклад, відповідних кетогруп, здійснюють окислення гідроксильних груп, гідроксилювання, а також окислення/відновлення зв‘язків вуглець-вуглець в ядрі молекули стероїду. Слідом за цією фазою І-го метаболізму відбувається ІІ-а фаза метаболізму, а саме - кон‘югація продуктів фази І з глюкуронідами або сульфатами.

Загальноприйняті стратегії ідентифікації метаболітів анаболічних стероїдів ґрунтується на ферментативному гідролізі метаболітів фази ІІ, в процесі якого утворюються метаболіти фази І, потім здійснюється їх очистка, концентрація, дериватизація і наступний аналіз ГХ-МС. Більшість метаболітів анаболічних стероїдів. за виключенням нандролону, про який мова піде нижче, не здатні утворюватися в організмі людини природним шляхом, через це у випадку виявлення цих сполук в сечі спортсмена підданого допінг-контролю, буде зроблено повідомлення про позитивні результати тесту.

Синтезовані стероїди. Проблема використання так званих сконструйованих стероїдів в спорті і в науковому світі наростає подібно до сніжної лавини, після того як у 2003р. лабораторія допінг-контролю виявила речовину, похідну гестринона – лікарського препарату, який використовувався для лікування ендометріозу. Гідрогенування його залишку призводить до утворення гормону тетрагідрогестринону (ТНУ), який може розглядатися як аналог високоефективного анаболічного стероїду тренболону, однак клінічні дослідження фізіологічного впливу й побічних ефектів ТНУ ніколи не приводились. Загальноприйнятих в дослідницьких лабораторіях стратегій допінг-контролю, які до сих пір були спрямовані на виявлення фармацевтичних препаратів, що пройшли випробування, виявились явно недостатніми для подолання бажання деяких спортсменів отримати перемогу над суперниками ошуканим шляхом, піддаючи ризику власне здоров‘я. Враховуючи той факт, що багато процедур скринінгу ґрунтуються на порівнянні зразків з пробами сечі з використанням таких методик мас-спектрометрії, як моніторинг заданих іонів (selected ion monitoring, SIM) або моніторинг множинних реакцій (multiple reaction monitoring, MRM), невідомі похідні або лікарські препарати, такі як ТНУ є «невидимими» для стандартних процедур контролю. Це обумовлює необхідність розробки гнучкіших методик контролю, які б дозволили детектувати як відомі, так і невідомі речовини, котрі володіють схожою структурою, що є в принципі можливо, зокрема, з використанням сучасних систем ГХ-МС/МС.

Ендогенні стероїди. Якщо у випадку використання анаболічних стероїдів які не зустрічаються в нормі, то їх виявлення не складає труднощів, але якщо застосовується тестостерон як допінг, то значно ускладнюється його тестування, оскільки він виробляється в організмі людини. З метою його виявлення були розроблені різні підходи, найбільш розповсюдженими є визначення співвідношення тестостерон/епітестостерон (Т/Е) і так зване мас-спектрометричне вимірювання співвідношення стабільних ізотопів вуглецю. Збільшення доступності ізотопного аналізу методом МС дозволило проведення низки досліджень, які показали можливість виявлення різниці між ендогенним і синтетичним тестостероном з допомогою даного підходу.

Діуретики і бета-2-агоністи. До речовин, аналіз яких звично здійснюється за допомогою ГХ-МС/МС, відносяться також діуретики і бета-2-агоністи. Зокрема група діуретиків характеризується хімічним розмаїттям препаратів, що призначаються у схожих або ідентичних випадках. Для представників цієї групи речовин використовується переважно негативна іонізація, що зумовлено їх кислотними властивостями, однак для деяких діуретиків, зокрема триамтерену, вимагається позитивна іонізація. Для бета-2-агоністів основним підходом є протонування речовин, що аналізується, з наступною детекцією позитивно зарядженої молекули. Для діуретиків, а також для переважної більшості бета-2-агоністів, за виключенням салбутамолу, достатньо проведення кількісного аналізу.

Кількісний аналіз заборонених субстанцій. Для деяких субстанцій, включно з стимуляторами на зразок ефедрину, метаболітів анаболічних стероїдів, таких як нандролон, і бета-2-агоністи, такі як сальбутамол, встановлений пороговий рівень, на основі порівняння з якими робиться висновок про позитивні та негативні результати тесту. Підґрунтям для такого рішення стали різні причини. Ефедрини входять до складу багатьох лікарських препаратів проти застуди, через це за антидопінговими правилами їх використання є законним, якщо вміст похідних норефедрину, ефедрину і псевдоефедрину в сечі не перевищує 5, 10 або 25 мг^.мл^-1 відповідно. Салбутамол відноситься до групи симпатоміметиків, є одним із чотирьох для використання бета-2-агоністів (поряд з салметеролом, тербуталіном і формотеролом) за умови їх використання у вигляді інгаляції. Оскільки визначити, як використовувався препарат (орально у вигляді таблеток або у вигляді аерозолю) і в якій дозі достатньо складно. Про присутність салбутамолу в пробах під час змагань повідомляють у відповідну федерація, якщо вміст речовини перевищує 100 нг^.мл^-1. В період між змаганнями встановлений пороговий рівень 1мг^.мл^-1, оскільки у випадку використання деяких симпатоміметиків в дозах, що суттєво перевищують терапевтичні, спостерігаються анаболічні ефекти. Присутність метаболіту нандролону (норандростерону) в сечі професійних спортсменів може бути в певній мірі обумовлено ендогенною продукцією, через це для речовини встановлений пороговий вміст 2 нг^.мл^-1 для чоловіків і 5мг.мл-1 для жінок. Для обґрунтування отриманих значень були проведені численні дослідження, також були враховані різні чинники, які можуть впливати на рівень ендогенного утворення цього метаболіту, наприклад, значний фізіологічний стрес або вагітність, які призводять до суттєвого підвищення вмісту цієї речовини в сечі. Кількісне визначення цих сполук здійснюється з використанням калібрувальних кривих, які будують на основі результатів визначення стандартними методами відповідних внутрішніх стандартів, що володіють схожими або ідентичними фізико-хімічними властивостями.

Таким чином, допінг-контроль низькомолекулярних сполук у спортсменів здійснюється на основі використання хроматографічних і мас-спектрометричних методів, які дають можливість виявити й ідентифікувати заборонені препарати та їх метаболіти в пробах біологічних рідин, таких як кров і сеча. В останній час використовується переважно рідинна хроматографія, продукти розділення якої після іонізації при атмосферному тиску піддаються мас-спектрометричному аналізу, оскільки даний підхід дозволяє суттєво скоротити час підготовки зразків.

З моменту створення списку заборонених препаратів і методів стимуляції діапазон речовин, яким приділяється увага під час проведення допінг-контролю розширюється, і лабораторіям в межах цього динамічного процесу доводиться постійно розширювати і модифікувати методи аналізу, підвищуючи їх чутливість, специфічність і пристосованість до вирішення нових завдань, щоб обмежити зловживання лікарськими препаратами в спорті, а також захистити спортсменів від хибних звинувачень. І тут нові розробки у сфері високошвидкісної й високоефективної хроматографії, мас-спектрометрії, що володіють високою специфічністю та чутливістю, а також сучасних прийомів іонізації надають аналітичним лабораторіям цінні інструменти, які дозволяють отримати ще ґрунтовнішу інформацію про використані речовини, наприклад, про їх структуру і метаболізм, і розширити тимчасові межі виявлення зловживання стимулюючими препаратами. Оскільки багато препаратів, таких, як анаболічні стероїди, використовуються в період між змаганнями, але при цьому зберігають свій стимулюючий ефект протягом декількох тижнів, для повноцінного допінг-контролю необхідно проведення аналізів як під час змагань, так і в післязмагальному періоді.