Изучение экспрессии генов: днк-микрочипы [3]
При изучении функции гена очень важно узнать, когда и в каких тканях организма он работает (экспрессируется), а также вместе с какими другими генами. Если требуется узнать это про небольшое число генов и тканей, то можно это сделать очень просто: выделить РНК из ткани, провести обратную транскрипцию (то есть, синтезировать кДНК — комплементарную ДНК) и затем, провести количественную ПЦР. В зависимости от того, прошла ли ПЦР, мы узнаем, имеется ли мРНК исследуемого гена в ткани.
Однако если необходимо проделать то же самое для множества тканей и многих генов, то эта методика становится очень долгой и затратной. В таком случае используют ДНК-микрочипы. Это небольшие пластинки, на которые нанесены и прикреплены молекулы ДНК, комплементарные РНК изучаемых генов, причем заранее известно, где на них (пластинках) какая молекула расположена. Одним из способов создания чипа является синтез молекул ДНК прямо на нем с помощью робота.
Рисунок 16. Флуоресценция на ДНК-микрочипе после обработки раствором кДНК. Всего тут примерно 37500 прикрепленных молекул ДНК. Картинка из вики-статьи «ДНК-микрочип».
Чтобы изучать экспрессию генов с помощью чипов, необходимо также синтезировать их кДНК и пометить ее флуоресцентным красителем (не разделяя кДНК разных генов). Такую смесь наносят на микрочип, добиваясь, чтобы кДНК гибридизовалась с молекулами ДНК на чипе. После этого смотрят, где наблюдается флуоресценция и сравнивают это с расположением молекул ДНК на чипе. Если место флуоресценции совпадает с положением молекулы ДНК, то в данной ткани этот ген экспрессирован. Кроме того, пометив кДНК из разных тканей разными красителями, можно изучать экспрессию сразу нескольких (обычно все-таки не больше 2) тканей на одном чипе: по цвету флуоресценции можно определить, в какой из тканей он экспрессирован (если сразу в нескольких — получится смешанный цвет) (рис. 16).
Однако в последнее время все чаще вместо чипов используют массовое секвенирование всей кДНК из ткани (создание так называемых транскриптомов), что сильно упростилось из-за развития методов секвенирования. Это оказывается дешевле и эффективнее, поскольку знание полных последовательностей всех мРНК дает больше информации, чем просто сам факт их наличия или отсутствия.
Мы рассмотрели основные методы молекулярной биологии. Надеюсь, что вам стало немного понятнее, каким образом делаются молекулярно-биологические исследования, за что дают Нобелевские премии, и как они могут помочь в некоторых прикладных задачах. Но, более всего, я надеюсь, что вы тоже увидели красоту идей, лежащих в их основе, и, возможно, вам захотелось узнать о каких-то из этих методик подробнее.
Литература
Нобелевские лауреаты: Дж. Уотсон, Ф. Крик, М. Уилкинс;
Уотсон Дж.Д. «Двойная спираль. Воспоминания об открытии структуры ДНК». М.: Мир, 1969;
Bruce Alberts et al., Essential cell biology, 3rd ed. (2009);
Википедия: «Центральная догма молекулярной биологии»;
Roberts RJ., Vincze T., Posfai J., Macelis D. (2007). REBASE—enzymes and genes for DNA restriction and modification. Nucleic Acids Res. 38, D234—D236;
Wikipedia: «Gel electrophoresis of nucleic acids»;
Wikipedia: «Southern blot»;
Жимулев И.Ф. Лекции для студентов 3-го курса по общей и молекулярной генетике (гл. 7);
Ребриков Д.В. ПЦР «в реальном времени». Москва: БИНОМ. Лаборатория знаний (2009);
Телков М.В. (2006). Кари Маллис, изобретатель ПЦР. Химия и Жизнь № 8 (2006);
Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487–491;
Ledergerber С., Dessimoz С. (2010). Base-calling for next-generation sequencing platforms. Brief. Bioinform. 12, 489–497;
биомолекула: «454-секвенирование (высокопроизводительное пиросеквенирование ДНК)»;
Wellcome Trust: «DNA Sequencing — The Illumina Method»;
биомолекула: «Обо всех РНК на свете, больших и малых»;
Grishok A. (2005). RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 579, 5932–5939;
Fortunato A., Fraser A.G. (2005). Uncover genetic interactions in Caenorhabditis elegans by RNA interference. Biosci. Rep. 25, 299–307;
Winston W.M., Molodowitch C., Hunter C.P. (2002). Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science 295, 2456–2459;
Hunter C.P. et al. (2006). Systemic RNAi in Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 71, 95–100.