Тема 3. Создание инфекционных фонов

Цель работы – изучить метод определения инфекционной нагрузки и получить навыки расчета оптимальной инфекционной нагрузки для создания инфекционных фонов.

Задачи:

1. Освоить метод определения инфекционной нагрузки;

2. Определить минимальную, оптимальную, максимальную инфекционную нагрузку.

Полученные знания углубляют понимание темы «Оценка устойчивости к заболеваниям и вредителям». Полученные навыки необходимы для правильной организации инфекционных фонов в селекционных учреждениях и в работе Государственной комиссии РФ по испытанию и охране селекционных достижений.

Базовый материал. Для продуктивной работы необходимы знания по следующим темам:

– Защита растений – Биология головневых грибов

– Иммунитет растений – Организация инфекционных фонов.

Студент должен владеть навыками работы с микроскопической и биохимической лабораторной техникой, полученными при изучении курса «Цитология» и данной дисциплины.

Входной контроль. Подготовьтесь к ответу на вопросы:

1) Что такое инфекционная нагрузка?

2) какой биологический смысл имеет оптимальная, минимальная, максимальная инфекционная нагрузка?

2) Каким образом происходит заражение пшеницы твердой и пыльной головней?

Работа 5. Определение инфекционной нагрузки

(1 час)

Теоретические пояснения

Определение инфекционной нагрузки имеет важное значение при создании инфекционных фонов, т.к. только при оптимальной инфекционной нагрузке удается получить максимальное проявление болезни в поле и лучшим образом оценить устойчивость образцов.

Как правило, перед организацией инфекционного фона проводят серию предварительных экспериментов, целью которых является определение оптимальных способов и условий заражения растений. В ходе экспериментов изучают интенсивность развития заболевания при разной инфекционной нагрузке. Затем строят график зависимости проявлений болезни от концентрации нанесенного инокулюма. По графику определяют пределы инфекционной нагрузки на растение (орган), при которых болезнь развиваются в максимальной степени (оптимальная инфекционная нагрузка.

Следует помнить, что развитие заболевания зависит от жизнеспособности спор патогена, а также влияния факторов среды. Поэтому значения оптимальной инфекционной нагрузки определяют для конкретных условий заражения и выращивания растений.

Материалы и оборудование

1. Образцы пшеницы, различающиеся инфекционной нагрузкой

хламидоспор твердой головни.

2. Микроскопы

3. Предметные стекла, покровные стекла размером 18х18 мм.

4. Колбы на 100 мл

5. Мерные пипетки объемом 10 мл

6. Микропипетки объемом 5 мкл

Порядок выполнения работы

Работа выполняется парами, данные в подгруппе обобщаются и анализируются совместно.

1. Отберите из образцов пробы семян по 100 зерен.

2. Поместите пробы в колбы, залейте 10 мл воды.

3. Взболтайте пробы в течение 3 мин.

4. Каплю суспензии спор объемом 5 мкл поместите на предметное стекло, накройте покровным стеклом, добейтесь равномерного распределения суспензии.

5. Определите количество хламидоспор в 3 полях зрения при 70-кратном увеличении микроскопа (объектив х10, окуляр х10). Высчитайте среднее количество спор в поле зрения.

6. Высчитайте количество спор в 10 мл суспензии, учитывая, что в одном поле зрения просматривается 3,53х10^-5 мл. Затем определите инфекционную нагрузку на 1 зерно. Для этого количество спор в суспензии поделите на 100 (количество взятых зерен).

7. Постройте график зависимости поражения образцов от инфекционной нагрузки. Для этого используйте данные о поражении твердой головней конкретных образцов в поле. По оси абсцисс отложите инфекционную нагрузку, а по оси ординат – поражение образцов (в %).

8. На графике отметьте минимальную инфекционную нагрузку –количество спор на зерно, при котором проявляется заболевание, оптимальную – интервал инфекционной нагрузки с максимальным проявлением заболевших растений в поле, максимальную –– выше которой начинается угнетение развития болезни.

Вид отчетности. Результаты представьте в тетради в виде:

1) расчета инфекционной нагрузки образца;

2) графика зависимости проявления заболевания в полевых условиях от инфекционной нагрузки образцов;

3) результатов определения минимальной, оптимальной, максимальной инфекционной нагрузки.

Работа 6. Заражение пшеницы пыльной головней с

помощью шприц-метода для создания инфекционного фона

(1 час)

Цель работы – освоить метод создания инфекционного фона на пыльную головню с помощью заражения шприцем колосьев пшеницы суспензией спор (шприц-метод).

Полученные знания углубляют понимание темы «Оценка устойчивости к болезням и вредителям». Полученные навыки необходимы для организации инфекционных фонов в селекционных учреждениях и в работе Государственной комиссии РФ по испытанию и охране селекционных достижений.

Базовый материал. Для работы необходимы знания по темам:

– Защита растений – «Биология головневых грибов»

– Иммунитет растений – «Организация инфекционных фонов;

Студент должен владеть навыками работы с микроскопической и биохимической лабораторной техникой.

Входной контроль. Подготовьтесь к ответу на вопросы:

1) Каким образом происходит заражение пшеницы твердой и пыльной головней?

2) Какие условия среды могут повлиять на оценку устойчивости растений к болезни?

Теоретические пояснения

Возбудители пыльной головни заражают злаки во время цветения. Для создания инфекционных фонов применяют принудительное заспорение рыльцев цветков хламидоспорами грибов. Для заражения колосьев используют свежий споровый материал, полученный на специально зараженных пыльной головней делянках растений. Использование прошлогоднего инокулюма нежелательно, потому что жизнеспособность спор быстро падает в процессе хранения.

Наиболее распространенными методами искусственного заражения злаков пыльной головней являются вакуум- и шприц-методы. Преимуществом первого метода является возможность одновременного заражения нескольких колосьев, а недостатком – высокие требования к качеству вакуумного оборудования, что необходимо для стабильной работы и стандартного заражения растений. Шприц-метод более трудоемкий, но дает стабильные результаты, поэтому соответствующем при навыке работы удобен для создания инфекционного фона.

Следует учитывать, что при принудительном введении хламидоспор в цветки преодолевается такой эффективный способ защиты злаков как закрытый тип цветения. Поэтому данный метод создает основу для более жесткого отбора растений, чем на естественном инфекционном фоне. При этом могут быть выбракованы ценные формы с закрытым типом цветения. Для их сохранения необходимы другие методы организации инфекционного фона

Материалы и оборудование

1. Побеги пшеницы в стадии цветения.

2. Колосья пшеницы, пораженные пыльной головней

3. Пипетки объемом 10 мл

4. Колбы объемом 100 мл

5. Микропипетки объемом 100, 500, 1000 мкл.

6. Пробирки

7. Шприцы объемом 5-10 мл, иглы для инъекций

8. Вода

9. Фарфоровые ступки, пестики

10. Предметные стекла, покровные стекла размером 18х18 мм

Порядок выполнения работы

Работа выполняется парами

1. Колосья пшеницы, пораженные пыльной головней, разотрите в фарфоровой ступке.

2. Добавьте в ступку 10 мл воды, тщательно перемешайте для получения суспензии хламидоспор, слейте суспензию в пробирки.

3. Нанесите 5 мкл суспензии на предметное стекло, накройте покровным, добейтесь равномерного распределения жидкости в препарате

4. Определите количество спор в поле зрения. Путем последовательных разведений приготовьте суспензию с оптимальной инфекционной нагрузкой (20-50 спор в поле зрения) (см. работу 5).

5. Наберите суспензию в шприц. Заразите колосья путем прокалывания иглой колосковых чешуй и введения капли суспензии (объем около 0,1 мл) в каждый цветок.

Вид отчетности: результаты работы представьте в тетради для лабораторных работ в виде:

1) описания способа приготовления суспензии спор для оптимальной инфекционной нагрузки;

2) описания хода работы.