Тема 2. Оценка неспецифической

устойчивости злаков к листовым болезням

Цель работы – освоение лабораторного метода оценки неспецифической устойчивости к листовым патогенам.

Задачи:

1. Освоить метод лабораторной оценки горизонтальной устойчивости растений;

2. Определить горизонтальную устойчивость сортов.

Полученные знания углубляют понимание следующих тем:

– Патологический процесс и механизмы устойчивости;

– Формы устойчивости растений.

Базовый материал. Для выполнения работы необходимы знания по следующим темам дисциплины:

– Патологический процесс и механизмы устойчивости растений-хозяев.

– Вертикальная, горизонтальная, полевая устойчивость.

Для выполнения работы необходимы навыки работы с микроскопом, статистической обработки результатов экспериментов, а также умение использовать бензимидазольный метод (занятие 1).

Входной контроль. Ответьте на вопросы:

1. Какие факторы неспецифической устойчивости можно выявить в лабораторных и полевых условиях?

2. Как развиваются болезни на сортах с неспецифической устойчивостью?

Работа 3. Заражение сортов овса инокулюмом популяции

корончатой ржавчины

(1 час)

Теоретические пояснения

Неспецифическая (горизонтальная, полевая) устойчивость растений к заболеваниям – умеренно выраженная устойчивость к широкому набору физиологических рас патогенов. Она может проявляться на этапах проникновения и развития патогена в тканях, что приводит к снижению пятен болезни, увеличению периода от заражения до проявления симптомов (инкубационная устойчивость) либо до размножения патогена (латентный период).

Неспецифическую устойчивость определяют:

1. особенности растения, приводящие к слабому накоплению и удержанию капельно-жидкой влаги (рыхлая форма куста, структура поверхности, острый угол отгиба листьев, наличие воскового налета и т.д.). Поскольку для прорастания и набухания спор грибов и бактерий нужна влага, то пониженная каплеудерживающая способность листьев обеспечивает частичное подавление развития поверхностных структур патогенов;

2. морфологические и физиолого-биохимические свойства растений, приводящие к снижению числа проникновений в ткани и ограничивающие число пятен болезни и интенсивность размножения паразитов.

Наиболее полную информацию о неспецифической устойчивости растений получают в полевых условиях, однако действие ряда факторов неспецифической устойчивости можно определить в лабораторных условиях с помощью методики отсеченных листьев (см. работу 1). При этом для определения неспецифической устойчивости растений используют интегральный показатель в виде количества спор возбудителя болезни, сформировавшихся на единице листовой поверхности. Корреляция между данными полевых испытаний (оценка по степени пораженности) и результатами лабораторной оценки устойчивости по описанному показателю составляет r = 0,87-0,92.

Лабораторная методика оценки неспецифической устойчивости растений может быть применена для ржавчинных и мучнисторосяных болезней различных зерновых культур.

Материал и оборудование

1. Проростки сортов овса, различающихся неспецифической устойчивостью к корончатой ржавчине

2. Инокулюм корончатой ржавчины, полученный размножением местной популяции патогена

3. Чашки Петри

4. Ножницы

5. Пинцеты

6. Центрифужные пробирки

7. Раствор детергента Твин-80 (0,001%)

8. Раствор бензимидазола (0,04%)

9. Предметные стекла

10. Покровные стекла размером 18х18 мм

11. Микроскопы

12. Микропипетки объемом 5 и 500 мкл.

Порядок выполнения работы

Работа выполняется парами.

1. Поместите на дно чашек Петри по 2 предметных стекла.

2. Нарежьте отрезки листьев длиной 4,5-5 см.

3. Уложите отрезки в чашки Петри, по 15 штук с каждой стороны. С одной стороны расположите листья сорта с горизонтальной устойчивостью, с другой – листья восприимчивого сорта (контроль). Для статистической обработки результатов нужно заложить 4-5 повторностей опыта на подгруппу студентов.

4. Нижние концы листьев накройте ватой, смоченной раствором бензимидазола.

5. Приготовьте суспензию урединиоспор гриба. Для этого стряхните инокулюм с листьев, зараженных популяцией патогена, в центрифужную пробирку. Добавьте в пробирку 0,5 мл (500 мкм) раствора детергента (Твина-80). Твин-80 обеспечивает смачивание поверхности спор и осаждение их в жидкости. Для равномерного распределения спор тщательно перемешайте палочкой смесь.

6. Равномерно заразите листья суспензией урединиоспор с помощью пульверизатора. На все чашки Петри нужно наносить одинаковое количество суспензии.

7. Подпишите чашки, отметив расположение сортов на бортике, а на крышке – дату заражения и инициалы исполнителей.

8. Чашки Петри с зараженными листьями поместите на одни сутки на рассеянный свет, затем на светоустановку с температурой 16-22^о на 8–10 сут.

Работа 4. Определение неспецифической устойчивости

образцов

(2 часа)

Порядок выполнения работы

Работа выполняется парами, результаты, полученные в подгруппе, обобщаются и анализируются совместно.

Учет и анализ результатов опыта проводят при появлении пустул на листьях, через 8-10 сут после заражения.

1. Стряхните урединиоспоры гриба в центрифужные пробирки, раздельно по каждому сорту с каждой чашки Петри (повторности опыта).

2. Приготовьте суспензию спор, собранных с каждого образца. Для этого с помощью микропипетки залейте споры 0,5 мл раствора Твина-80, тщательно размешайте для равномерного распределения спор.

3. Приготовьте микроскопические препараты из суспензий спор, выращенных на разных по устойчивости сортах. Для этого нанесите с помощью микропипетки 5 мкл суспензии на предметные стекла, накройте покровными стеклами, добейтесь равномерного распределения суспензии между стеклами.

4. Подсчитайте количество спор в 2 полях зрения по каждому препарату при 70-кратном увеличении (увеличение окуляра х7, объектива – х10). Вычислите среднее значение для каждой повторности опыта.

5. Запишите результаты опыта в таблицу (табл. 3). Результаты, полученные разными парами студентов, рассматриваются как повторности.

6. Вычислите с помощью составления пропорции общее количество урединиоспор, сформировавшихся на листьях каждого образца. При этом необходимо иметь в виду, что в поле зрения содержится объем суспензии равный 3,53х10^-5 мл, а споры были растворены в 0,5 мл жидкости.

7. Проведите однофакторный дисперсионный анализ и докажите достоверность различий между образцами по неспецифической устойчивости. Формулы для проведения анализа приведены в таблице 4.

Рекомендации по выполнению работы

При выполнении работы определяют количественные параметры устойчивости сортов. Для повышения достоверности опыта необходимо тщательно соблюдать методику, повторности опыта должны быть выполнены одинаково. При закладке опыта важно сделать так, чтобы суммарная площадь зараженных листьев (т.е. количество листьев и их размеры) были одинаковы в различных чашках Петри. При заражении листьев суспензией спор капли должны равномерно покрывать листья анализируемых и контрольных растений. Перед заражением суспензию необходимо тщательно перемешать. При подготовке микроскопического препарата каплю суспензии рекомендуется брать из средней части пробирки.

При правильном выполнении опыта различия между повторностями по каждому образцу должны быть небольшими. Дисперсия будет определяться различиями образцов по неспецифической устойчивости. Различия между сортами по устойчивости к болезни считаются достоверными, если F_ф > F_т.

.

Таблица 5

Результаты изучения неспецифической

устойчивости сортов овса к корончатой ржавчине

Варианты	Образец	Среднее количество спор в поле зрения в повторностях, шт. (Xi)					Число наблюдений n	Сумма по вариантам V	Средние по вариантам xi
1							n1	V1	x1
2							n2	V2	x2
							nl	Vl	xl
l		Общая сумма X					N=n	X=V	х= X/N

N – общее число наблюдений,

l - количество вариантов

Вид отчетности. Результаты опыта необходимо представить в тетради для лабораторных работ в виде:

1) расчетов количества спор, собранных с разных образцов в 4–5 повторностях;

2) результатов дисперсионного анализа опыта;

3) выводов о различиях по горизонтальной устойчивости между сортами

Таблица 4

Формулы для вычисления сумм квадратов отклонений,

дисперсий и критерия F_ф

Дисперсия	Сумма квадратов	Степени свободы	Средний квадрат s2	Fф	Fт
Общая CY	X2 − C	N − 1	-	-	-
Вариантов CV	V2 : n − C	l −1	s2v	s2v / s2	По таблице
Остаток СZ (ошибки)	CY − CV	N − l	s2	-
C = (X)2 : N – корректирующий фактор, поправка