ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ бюджетное ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОфессионального образования
«омский государственный аграрный уНИВЕРСИТЕТ
имени П.А. Столыпина»
(ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина)
Кафедра селекции, генетики и физиологии растений
Л.Я. Плотникова, Н.В. Дергачева
УМКД
ИММУНИТЕТ РАСТЕНИЙ
И СЕЛЕКЦИЯ НА УСТОЙЧИВОСТЬ
К БОЛЕЗНЯМ И ВРЕДИТЕЛЯМ
Методические указания
к лабораторным занятиям
по дисциплине «Иммунитет растений и селекция на устойчивость
к болезням и вредителям»
в составе ООП ВПО 110204.65 – Селекция
и генетика сельскохозяйственных культур
2-е издание, переработанное
Рекомендовано методической комиссией по специальности 110204.65 –
Селекция и генетика сельскохозяйственных культур
Омск
Издательство ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А.Столыпина
2011
УДК632.938 : 631.527
ББК 44.9 : 41.3
Ответственный за выпуск: заведующий кафедрой Н.Г. Казыдуб
Рецензент: доцент кафедры лесоводства и защиты растений ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина О.А. Шмакова
|
© Плотникова Л.Я., Дергачева Н.В., 2011 © ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина, 2011 © Оформление. Издательство ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина, 2011 |
ВВЕДЕНИЕ
«Методические указания к лабораторным занятиям» являются частью учебно-методического комплекса по дисциплине «Иммунитет растений и селекция на устойчивость к болезням и вредителям», которую изучают студенты специальности 110204.65 – Селекция и генетика сельскохозяйственных культур. Они разработаны в соответствии с ГОС ВПО (2000 г.) и на основе рабочей программы дисциплины, утвержденной деканом в 2007 г. Дисциплина является компонентом федерального компонента цикла специальных дисциплин, ее изучают в 7 семестре. Трудоемкость дисциплины составляет 90 ч, из них 14 выделены на лабораторные занятия для студентов очной формы обучения.
Целью издания является оказание методической помощи студентам на лабораторных занятиях по дисциплине. Данные методические указания предназначены для организации 21 ч работы студентов (из них аудиторной – 14 ч), включая лабораторные занятия, а также оформления отчетов во внеаудиторное время.
В методической разработке представлены задания для 7 лабораторных занятий, на которых выполняется 9 работ. Работы № 1–4 ориентированы на углубленное изучение материала по разделу «Иммунитет растений». Работы № 5–9 посвящены изучению основных методов, применяемых для организации инфекционных фонов, а также оценке устойчивости растений к болезням. Полученные на лабораторных занятиях знания и навыки дополняют и углубляют изучение материала основных разделов дисциплины. При выполнении работ формируются навыки изучения популяций патогенов, полевой и лабораторной оценки устойчивости растений, необходимые в работе селекционеров, семеноводов, иммунологов, специалистов Государственной комиссии РФ по испытанию и охране селекционных достижений.
Для удобства работы методические указания снабжены рекомендациями по подготовке к занятиям, описан ход выполнения работ, указана форма представления результатов. Подготовка к занятиям заключается в повторении теоретического материала изучаемой или предшествующих дисциплин с помощью рекомендованной учебной и учебно-методической литературы.
Отчеты по выполненным работам должны быть обсуждены в ходе собеседования с преподавателем.
При разработке «Методических указаний к лабораторным занятиям» учтена региональная специфика, методы работы иллюстрируются на примерах наиболее распространенных в Западной Сибири сельскохозяйственных культур и их болезней. Список учебной литературы, необходимой для подготовки к занятиям, приведен в конце издания.
Данное издание разработано профессором кафедры селекции, генетики и физиологии растений ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина докт. биол. наук Л.Я. Плотниковой и заведующей лабораторией селекции картофеля СибНИИСХ канд. с.-х. наук Н.В. Дергачевой.
Тема 1. Изменчивость патогенов. Определение
физиологических рас и генетической структуры
популяции возбудителя бурой ржавчины
Цель работы – изучение генетической изменчивости в популяции возбудителя ржавчины пшеницы с помощью метода отсеченных листьев.
Задачи:
1) освоить метод отсеченных листьев;
2) определить принадлежность клона к физиологической расе;
4) изучить расовый состав популяции.
Полученные знания и навыки углубляют понимание следующих тем дисциплины:
- Сопряженная эволюция растений-хозяев и патогенов.
- Теория Флора «ген-на-ген». Генетика устойчивости растений.
- Генетика популяций
Знания и навыки необходимы в работе иммунологов и селекционеров : 1) для контроля расового состава популяций патогенов; 2) для оценки устойчивости селекционного материала; 3) при разработке стратегии размещения устойчивых сортов.
Базовый материал. Студент должен владеть знаниями по темам следующих дисциплин:
- Защита растений – Биология ржавчинных грибов;
Иммунитет растений – Теория Флора «ген-на-ген», Генетика устойчивости растений, Генетика популяций.
Студент должен обладать навыками работы с микробиологическими объектами, полученными при изучении дисциплины «Микробиология» (работа со спиртовкой, стерилизация инструментов).
Входной контроль. Ответьте на вопросы:
1) Что такое специализированная форма, физиологическая раса, биотип?
2) Какими генами отличаются физиологические расы?
3) Что такое стандартная шкала сортов-дифференциаторов?
4) Что такое «таблицы-ключи» для определения физиологических рас патогенов?
Теоретические пояснения
Популяции возбудителей ржавчинных заболеваний полиморфны по способности поражать разные по генам устойчивости сорта. В основе различий между формами лежат свойства вирулентности паразитических грибов.
Популяции ржавчинных грибов разделяются по признаку вирулентности к сортам на ряд физиологических рас, отличающихся набором генов вирулентности. Определение физиологических рас проводится путем изучения взаимодействия изолятов (штаммов) патогена с набором сортов-дифференциаторов, несущих разные гены устойчивости к ржавчине. Генетически однородные клоны патогена получают путем размножения потомства одной споры или пустулы (моноспоровый или монопустульный инокулюм).
Для стандартизации определения рас и возможности сравнения результатов созданы международные наборы сортов-дифференциаторов. Стандартный набор для определения физиологических рас возбудителя бурой ржавчины включает сорта: Малакофф, Медитерраниум, Гуссар, Демократ, Карина, Бревит, Вебстер, Лорос. При определении типа реакции сортов-дифференциаторов на заражение ржавчиной используют шкалу, разработанную Майнсом и Джексоном (рис.1, табл. 1)
Принадлежность изучаемых изолятов к расе определяется путем сравнения реакции на заражение набора сортов-дифференциаторов со стандартными таблицами – «ключами». Ниже приведена часть ключа, показывающая реакцию набора сортов-дифференциаторов на заражение наиболее распространенными в Западной Сибири физиологическими расами бурой ржавчины (табл. 2). Для определения более мелких единиц внутри физиологических рас (биотипов) стандартный набор сортов-дифференциаторов дополняют сортами и линиями, устойчивыми к местной популяции патогена.
Взаимодействие пшеницы с паразитическим грибом проводят в лабораторных условиях по методу отсеченных листьев. Для замедления старения отрезков листьев используют аналог растительного гормона кинетина – бензимидазол. Этот метод широко
Балл 0 1 2 3 4
Рис.1. Шкала Майнса и Джексона для определения типа реакции растений пшеницы на заражение бурой ржавчиной
Таблица 1
Шкала Майнса-Джексона для определения типа реакции пшеницы на заражение бурой ржавчиной
Класс реакции* |
Тип реакции, балл |
Определение устойчивости образца и симптомы болезни |
R |
0 |
Иммунный. Уредопустулы не образуются. Возможны мелкие некротические и хлоротические пятна |
R |
1 |
Высокоустойчивый. Пустулы очень мелкие, изолированные, расположены на резко очерченных больших некротических пятнах. Наблюдается большое количество некротических пятен без пустул. |
R |
2 |
Умеренно устойчивый. Пустулы небольшие или среднего размера. Некроз в виде венчиков или кружков, пустулы обычно на светло-зеленых хлоротических пятнах. |
S |
3 |
Умеренно восприимчивый. Пустулы среднего размера, сливаются редко, развитие ржавчины ниже нормального, возможен хлороз. |
S |
4 |
Сильно восприимчивый. Пустулы большие, сливающиеся. Некроз отсутствует, хлороз может проявляться при неблагоприятных условиях. |
* R – устойчивый, S – восприимчивый.
Таблица 2
Реакция набора сортов-дифференциаторов на заражение
физиологическими расами бурой ржавчины
Сорта-дифференциаторы |
Гены устойчивости |
Раса |
||
57 |
61 |
77 |
||
Малакофф |
Lr 1 |
R |
R |
S |
Карина |
Lr2b |
S |
R |
S |
Бревит |
Lr2c |
S |
S |
S |
Вебстер |
Lr2a |
S |
R |
S |
Лорос |
Lr2c |
S |
S |
S |
Медитерраниум |
Lr3 |
S |
S |
S |
Гуссар |
Lr11 |
S |
S |
S |
Демократ |
Lr3a |
S |
S |
S |
R – устойчивый класс реакции (0-2 балла);
S – восприимчивый класс реакции (3-4 балла).
применяют в фитоиммунологии и селекции растений на иммунитет, так как он отличается малой трудоемкостью и позволяет анализировать большое количество материала в течение года. Аналогично с помощью соответствующих наборов сортов-дифферен-циаторов определяют физиологические расы других листовых патогенов: стеблевой ржавчины и мучнистой росы пшеницы, ржи, ячменя, корончатой ржавчины овса и т.д.
Материал и оборудование
Моноспоровые клоны возбудителя бурой ржавчины
Проростки сорта Память Азиева – стандарта восприимчивости к бурой ржавчине.
Проростки сортов-дифференциаторов пшеницы
Чашки Петри
Спиртовки
Пинцеты
Спирт 96%
Вата
9. Раствор бензимидазола (0,004%).
Работа 1. Освоение метода отсеченных листьев
(2 часа)
Порядок выполнения работы
Работа выполняется парами
1. Выложите стерильные чашки Петри ровным слоем ваты толщиной 0,5 см.
2. Смочите вату 0,004%-ным раствором бензимидазола. Добейтесь равномерного смачивания ваты и плотного ее прилегания к донышку чашки путем легкого постукивания пальцами. Слейте лишний раствор бензимидазола.
3. Подготовьте отрезки листьев сорта-стандарта, а также сортов-дифференциаторов длиной 0,8 см (по 5 шт. каждого сорта).
4. Выложите отрезки листьев каждого сорта в 5-кратной повторности в соответствии со схемой (рис. 2) (Малакофф, Карина, Бревит, Вебстер, Лорос, Медитерраниум и т.д.). Для лучшего заражения листья должны быть обращены к вате нижней стороной.
5. Разложенные в чашках Петри отрезки листьев пшеницы сбрызните водой из пульверизатора, добиваясь образования и равномерного распределения капель по поверхности листьев.
6. Равномерно заразите листья путем стряхивания уредоспор с зараженных листьев пшеницы с хорошо развитыми уредопустулами.
7. Закройте чашки Петри, напишите на крышке обозначение клона ржавчины, дату заражения и инициалы исполнителя.
8. Поместите чашки в темное место с умеренной температурой на 1 сут. Затем чашки Петри с зараженными листьями держат на светоустановке при температуре 15-25о. в течение 7-10 суток до развития пустул гриба.
Рекомендации по выполнению работы
При выполнении заданий необходимо обратить внимание на то, чтобы слой ваты располагался и смачивался равномерно. Отрезки листьев должны плотно прилегать к вате, иначе стимулирующего влияния бензимидазола будет недостаточно для поддержания их жизнеспособности, листья высохнут. В результате реакцию невозможно будет определить. Перед заражением нужно добиться равномерного смачивания листьев в форме маленьких капель. Капли воды должны быть небольшими, т.к. при избытке влаги инокулюм может стечь с водой на вату.
|
Рис. 2. Схема размещения в чашке Петри отсеченных листьев для определения типа реакции сортов-дифферен-циаторов
|
Работа 2. Определение физиологических рас и
расового состава популяции возбудителя бурой ржавчины
(1 час)
Порядок выполнения работы
Учет и анализ результатов проводят через 7-10 суток после заражения листьев спорами возбудителя бурой ржавчины. Работу выполняют парами, результаты работы в подгруппе обобщают и анализируют совместно.
1. Рассмотрите зараженные отрезки листьев. Определите тип реакции сорта Памяти Азиева – стандарта восприимчивости. На отрезках его листьев должны развиваться крупные пустулы без признаков нарушения взаимодействия (без некроза и хлороза). Такая реакция оценивается 4 балами и относится к восприимчивому классу S. Если на листьях проявляются симптомы защитных реакций (белые, желтые или светло-зеленые пятна), то условий для успешного развития гриба не было, и опыт должен быть переделан.
2. Определите тип реакции каждого сорта-дифференциатора в баллах и класс реакции по шкале Майнса-Джексона (таблица 1, рисунок 1). К устойчивому типу “R” относятся образцы с баллами иммунности 0-2, к восприимчивому “S” – с баллами 3-4.
3. Запишите результаты опыта в виде таблицы, показывающей балл и класс реакции каждого сорта-дифференциатора.
4. Сравните полученные результаты с таблицей-ключом.
5. Сделайте вывод о принадлежности клона к физиологической расе.
6. Запишите генотип клона по формуле Грина. Для этого сначала перечислите гены авирулентности, затем через знак «/» – гены вирулентности, комплементарные генам устойчивости растений.
7. Обобщите данные, полученные другими студентами в подгруппе, и сделайте вывод о генетической структуре популяции западносибирской популяции возбудителя бурой ржавчины. Для этого рассчитайте, в каком соотношении в популяции представлены клоны, относящиеся к одним физиологическим расам (%).
Вид отчетности. Результаты должны быть представлены в тетради для лабораторных работ в виде:
таблицы, показывающей тип реакции (в баллах) и класса реакции (устойчивый или восприимчивый) сорта-стандарта и сортов-дифференциаторов;
вывода о принадлежности клона к физиологической расе;
формулы генотипа клона по Грину;
вывода о генетической структуре популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы.