5. Выявление белковых партнёров FbaB в e.Coli

Очевидно, FbaB в клетке взаимодействует с рядом белковых партнёров. Те из них, синтез которых регулируется общим репрессором или активатором (а также расположенные с FbaB в одном опероне), можно обнаружить измерением уровня экспрессии различных белков в FbaB-нокаутном штамме и в контроле. Это измерение производится с помощью специального протеомного анализа, основанного на выделении и разделении суммарного белкового препарата для двух разных штаммов. Разделение проводится с помощью двумерного гель-электрофореза, белковые пятна прокрашиваются специальными флуорогенными красителями, после чего идентичные по положению пятна в двух штаммах сравниваются по интенсивности. Различие в экспрессии более чем в 2 раза может указывать на функциональную связь данного белка и FbaB.

Для выявленных белков можно получить (или использовать готовые) штаммы, нокаутные по их гену, и протестировать их на отношение к стрессу. Если культура нокаутного по изучаемому белку штамма замедляет рост при тех же условиях, что и нокаутнаяпо FbaB, то можно с большей уверенностью утверждать, что данный белок функционально связан с FbaB в ходе ответа на этот стресс.

Для выявленных функциональных партнеров FbaB необходимо будет провести эксперименты, доказывающие их физическое взаимодействие. Для этого можно использовать, например, метод металлоаффинной хроматографии: один из белков- партнеров экспрессируют с аффинным тагом (например, вставкой из шести остатков His на конце полипептидной цепи), смешивают с вторым белком и наносят на колонку с аффинным сорбентом (например, Ni-хелатирующей смолой). В случае физического взаимодействия между белками они оба будут удерживаться на смоле и смываться с нее только при особых условиях (например, высокой концентрации имидазола).

Данное исследование позволит более определённо указать роль FbaB в жизнедеятельности E.coli в условиях того или иного стресса, а также, возможно, выяснить ее участие в других клеточных процессах. Сведения о функции FbaB как стрессового белка могут послужить основой для выдвижения гипотез о конкретных механизмах реакции клетки на стресс. Это поможет открыть и исследовать химические процессы, к катализу или регуляции которых способен этот фермент invivo, что может послужить основой для создания новых антибактериальных средств.

Влияние нокаута гена fbaB на адаптацию e.Coli к различным видам стресса.

(Экспериментальная часть)

В данной работе был начат эксперимент по изучению выживаемости штамма E.coli с нокаутом гена fbaB (ΔfbaB) в условиях стресса. В качестве контроля использовали нативный штамм, а также ряд штаммов с нокаутом генов известных стрессовых белков.

Оборудование и реактивы.

Культуры штаммов E.coli, нокаутных по следующим генам: fbaB, gadA, kduI, lpd, ulaB, а также культуру контрольного нативного штамма E.coli брали из библиотеки модифицированных штаммов (…). Для приготовления среды LB применяли готовую сухую смесь реагентов. Клеточные культуры выращивали в инкубируемом шейкере фирмы (…). Измерения светопоглощения вели на спектрофотометре Pharmacia LKB Ultrospec Plus.

Методики.

1. Выращивание ночной культуры. Для выращивания ночной культуры готовили среду LB из расчёта 1 г готовой смеси экстрактов на 40 мл дистиллированной H₂O. Среду стерилизовали автоклавированием в течение 1 часа. В стерильные бакпечатки помещали по 1,5 мл стерилизованной среды. В 5 из них (кроме контрольной) добавлялось по 3 мкл 25 % раствора канамицина. Заражали среду соответствующим штаммом и инкубировали в течение ночи при 37˚С при перемешивании.

2. Выращивание культуры штаммов E.coli в нормальных условиях. В стерильные пробирки помещали по 3,5 мл стерильной среды LB, добавляли в каждую по 25 мкл ночной культуры соответствующего штамма и ставили в инкубируемый шейкер на 37˚С. После 2 часов инкубации каждые 20-25 мин из пробирки отливали около 1 мл клеточной суспензии и измеряли светопоглощение при длине волны 600 нм. Строили графики зависимости D₆₀₀ от времени инкубации и по прямым участкам определяли тангенс угла наклона, соответствующий скорости роста культуры данного штамма.

3. Выращивание культуры штаммов E.coli в стрессовых условиях. Опыт проводили аналогично п. 2, за исключением состава среды. В первом варианте (сильнокислая среда) брали по 4,5 мл стерильной среды LB, подкисленной 6 M HCl до pH 6,1, и добавляли в каждую по 30 мкл ночной культуры соответствующего штамма. Во втором варианте (умеренно кислая среда) брали по 4,5 мл стерильной среды LB, подкисленной 6 M HCl до pH 4,5.

Результаты.

В экспериментальной части работы удалось измерить только скорости роста штаммов E.coli в нормальных и слабокислых условиях, т.к. в сильнокислой среде, по-видимому, к концу времени измерения клеточные культуры не успели выйти из индукционного периода. Графики полученных зависимостей для контрольного штамма и ΔfbaB показаны на Рис. 3. Тангенсы угла наклона прямых участков составили: (…) Из полученных результатов можно сделать вывод, что альдолаза I класса FbaB не нужна клеткам E.coli ни для роста в нормальных условиях, ни для адаптации к слабокислой среде.

а)	б)
Рис. 3. Рост клеток нативного штамма E.coli (красными кружочками) и ΔfbaB в нормальных условиях (а) и при рН 6,1 (б).