2. Фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза класса I как белок ответа на стресс в e.Coli

(Обзор литературы)

1. Классификация альдолаз.

Альдолазы – группа ферментов, относящихся к классу лиаз и катализирующих реакции альдольного расщепления. Фруктозо-1,6-бифосфатальдолазы (Fba), в частности, отвечают за разложение фруктозо-1,6-бифосфата (FBP, рис. 1), реакцию первой фазы гликолиза. Обратная реакция, также катализируемая этими ферментами, является одной из стадий глюконеогенеза – синтеза глюкозы из неуглеводных источников.

Рис. 1. Реакция, катализируемая фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазой.

Рис. 2. Схема каталитического действия альдолазы класса I.

Альдолазы как таковые делятся на два принципиально различных и, очевидно, генетически не родственных класса, I (FbaB) и II (FbaA). Ферменты обоих классов катализируют депротонирование гидроксильной группы и последующий разрыв связи C-C. Разница между ними состоит в механизме атаки на субстрат - FBP. В реакции с участием альдолазы класса I формируется основание Шиффа между карбонильной группой FBP и аминогруппой остатка лизина в активном центре фермента (Рис. 2). Сдвиг электронной плотности позволяет соседней OH-группе депротонироваться, что приводит к расщеплению связиС-С. В альдолазах класса II роль электрофильного реагента, поляризующего карбонильную группу, выполняет двухвалентный катион, как правило, Zn²⁺, который содержится в молекуле фермента.

Различие в механизме позволяет дифференциально определять активность альдолаз двух классов, используя селективные ингибиторы. Ингибиторами для альдолаз класса I являются восстановители, превращающие основание Шиффа в устойчивую связь, а для альдолаз класса II – комплексообразователи, связывающие кофакторный ион металла в прочный комплекс [1].

2. Экспрессия FbaB в различных организмах.

Первоначально альдолазы класса I были открыты у растений и животных, позже – у архей. Долгое время считалось, что этот класс ферментов не характерен для эубактерий, которые в качестве основной гликолитической альдолазы синтезируют альдолазы класса II. Однако спустя некоторое время ряд исследований на различных микроорганизмах [2-5] выявил присутствие в их геномах (в дополнение к генам fbaA, кодирующим альдолазы класса II) генов fbaB, кодирующих альдолазы класса I. Для некоторых бактерий (включая Escherichiacoli и Micobacteriumtuberculosis) присутствие альдолазFbaB была показана на уровне экспрессии активного белка. Впоследствии было составлено филогенетическое древо альдолаз класса I [7]. Эти данные показали, что альдолаза класса I – не принадлежность исключительно эукариот, как считалось прежде. Таким образом, фермент класса I либо существовал в живой природе до дивергенции на прокариот и эукариот, либо возник повторно конвергентным путём у эубактерий [2].

Высшие эукариоты экспрессируют исключительно Fbaкласса I. В организме человека присутствуют три тканеспецифичных типа альдолаз: печени, мышц и мозга. Качественные реакции на альдолазу класса I находят практическое применение в медицине. В норме альдолазы существуют в цитоплазме клеток тканей и не секретируются в кровь; наличие альдолазной активности в сыворотке крови свидетельствует о патологиях, сопровождающихся разрушением тканей (в том числе о скрытой травме головного мозга). Кроме гликолитической функции, альдолаза печени является ключевым ферментом метаболизма фруктозы. Генетически обусловленные дефекты в гене этого фермента приводят к мутациям, в результате чего развивается патология, известная как «непереносимость фруктозы». Эта патология потенциально летальна, если ее не распознать на ранних стадиях жизни ребенка. Таким образом, исследование альдолаз имеет и прикладное значение.

Альдолазы класса I из различных царств значительно различаются по аминокислотной последовательности. Степень идентичности между альдолазами класса I упрокариот и эукариот составляет 17-28%, в то время как внутри одного царства она значительно выше (например, между ферментами эукариот – не менее 50%). Антитела к альдолазам млекопитающих также не дают реакции с FbaB из E.coli. Такая же низкая степень идентичности (не выше 26%) наблюдается и при сравнении последовательностей FbaB из эубактерий и архей. Таким образом, в филогенетическом древе альдолаз класса I фермент из E.coli стоит в особой ветви дендрограммы.

Ряд низших эукариот, например, Euglenagracilis, Chlamydomonasmundana, Chlamydomonasrheinhardii, подобно E.coli, синтезируют альдолазы как класса I, так и класса II в различных пропорциях, в зависимости от условий. Синтез ферментов обоих классов позволяет предположить, что помимо основной функции – катализа альдольного расщепления – альдолазы имеют ряд других жизненно важных функций в клетке, различных у классов I и II.

В клетках E.coliальдолаза класса I была впервые обнаружена при изучении ранее известной альдолазы класса II у этого микроорганизма [2]. Отнесение вновь открытого фермента, катализирующего распад FBP, к классу I основывалось на следующих признаках:

1. Активность фермента не ингибировалась даже высокими концентрациями ЭДТА, к которой очень чувствительныальдолазы класса II, содержащие катион металла.

2. Фермент подвергался необратимому ингибированию NaBH₄ в присутствии субстрата (что указывает на существование основания Шиффа в качестве интермедиата).

3. Фермент также был чувствителен к N-этилмалеимиду, что характерно для альдолаз класса I.

Ранние исследования показали, что альдолазаFbaB в E.coli представляет собой октамер (что не характерно для других альдолаз) с молекулярной массой 303,8 кДа. В настоящее время эти сведения откорректированы и показано, что фермент функционирует как декамер с молекулярной массой 380 кДа. Учитывая, что большинство бактериальных альдолаз (FbaА, т.е. класса II), как правило, образуют моно-, ди- или тетрамеры, а для эукариотическихFbaB характерны тетрамеры, следует ожидать, что сложная олигомерная структура у фермента E.coli нужна для выполнения им другой функции, кроме катализа расщепления FBP [2, 6].

Было также установлено, что субъединица бактериальной FbaB может существовать в двух формах: полной (full-length), соответствующей открытой рамке считывания у гена FbaB, и зрелой (mature), укороченной на 24 аминокислотных остатка с N-конца[7]. Каталитические свойства обеих форм в реакции альдольного расщепления одинаковы. Invivo присутствуют одновременно обе формы, что может указывать на функциональное различие двух белков [6].