1. Определение видов стресса, в ответе на которые в e.Coli может участвовать FbaB

Установление участия FbaB в реакции клеток на разные виды стресса invivo возможно с помощью эксперимента на штамме E.coli, нокаутном по гену FbaB. Эксперимент заключается в наблюдении роста культуры модифицированной E.coli в условиях определённого стресса (параллельно с контрольным образцом, в качестве которого будет взята культура немодифицированного штамма). Скорость роста планируется определять спектрофотометрически, отбирая пробы заражённой среды через каждые 10-30 мин и регистрируя мутность клеточной суспензии, которая пропорциональна концентрации клеток.

Возможно включить в опыт, кроме нокаутного по FbaB штамма и дикого типа, штаммы с нокаутом каких-либо других генов стрессовых белков, конкретная функция которых в адаптации уже была установлена. Это позволит оценить степень задействования альдолазыFbaB в приспособлении к экстремальным условиям: является ли она незаменимым стрессовым белком или же вспомогательным, отсутствие которого компенсируется повышенной экспрессией других белков со сходной функцией.

Прежде чем приступать к измерениям роста культур в условиях стресса, необходимо сравнить жизнеспособность нокаутного по FbaB и нативного (WT) штаммов в некоторых базовых условиях роста (в отсутствие стрессовых факторов). Мы планируем использовать в качестве базовых следующие условия: среда LB, 5% NaCl, 37C. У нативного штамма E.coli, выращенного в таких условиях, экспрессии FbaB не обнаружено. Поэтому можно ожидать, что различия в скорости роста на этой среде при стрессе у нокаутного штамма и WT будут вызваны именно стрессовыми условиями.

В качестве исследуемых стрессовых условий целесообразно выбрать как условия, в которых экспрессия FbaB достоверно увеличивается (согласно данным литературы), так и условия, про которые этого неизвестно. Интерес для исследования в первую очередь представляют следущие модификации базовых условий:

1. Отличные от глюкозы источники углерода. В культуре E.coli, выращенной на глюкозо-содержащей среде, альдолазыFbaB не обнаружено. В то же время на источниках, отличных от сахаров (пирувате, лактате), существует повышенная экспрессия FbaB. Если FbaB, как предполагается в литературе, играет основную роль в синтезе глюкозы из неуглеводных источников (т.е. в глюконеогенезе), то логично ожидать, что рост культуры нокаутного штамма в этих условиях будет подавлен. В данном опыте предлагается использовать в качестве источников углерода как неуглеводные органические соединения (глицерин, ацетат), так и сахара (например, мальтозу и маннозу). Таким образом, можно будет сделать вывод о том, действительно ли основная роль FbaB заключается в активации глюконеогенеза или же её функция несколько иная.

2. Стационарная фаза. Данный этап роста клеточной культуры относится к стрессовым условиям, т.к. на этой стадии роста концентрация питательных веществ в среде значительно снижается. Основным источником углерода на этой стадии служит ацетат и другие карбоновые кислоты. Этот эксперимент позволит сравнить поведение нокаутного по FbaB и нативного штаммов в условиях более глобального голодания, т.к. в стационарной фазе снижена концентрация и других важных элементов – фосфора, магния и т.д.

3. Анаэробные условия. Ряд метаболических процессов у бактерий при нехватке кислорода принципиально меняется. Это вызвано изменением экспрессии разнообразных регуляторных и эффекторных белков, срели которых (по данным для M. tuberculosis) и альдолазаFbaB. В E.coli этого не было показано. Если и в E.coliFbaB участвует в переходе от аэробной жизнедеятельности к анаэробной, либо собственно в анаэробном метаболизме, то в обоих случаях будет наблюдаться снижение скорости роста у нокаутного штамма по сравнению с контролем.

4. Планируется изучить поведение нокаутного по FbaB штамма E.coli в ряде нестандартных условий, влияние которых на выработку белка FbaB до сих пор не было исследовано:

- Кислый стресс (как сильнокислый, pH около 4, так и умеренный, pH 6-6,5).

- Присутствие токсичных ионов (например, ионов тяжелых металлов).

- Окислительный стресс.

- Аномальные температурные условия (перегрев и переохлаждение в пределах жизнеспособности E.coli).