Материалы и методы
В подготовленный раствор с AuNPs (V=25 mL, c=0.04µМ) было добавлено 15 г BSPP, перемешено и оставлено на ночь при комнатной температуре. На следующий день в раствор добавили раствор NaCl (приливается постепенно, постоянно помешивая, пока окраска раствора с красной не станет серо-синей). Далее полученный раствор переносится на центрифугу на 20 минут при 3500об. Таким образом, были осаждены н/ч; верхний слой воды сливается и оставшиеся н/ч растворяются в фосфатном буфере (1mg:1mL H20) до финальной концентрации н/ч 20 µМ. Затем добавляются олигонуклеотиды (mazh-3 5'> TTT TTT TTT TTT AGG GTT AGG G <3' концентрация 208µМ, mazh-4 5'> TTT TTT TTT TTT AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G <3 концентрация 180,36µМ и pA30 концентрация 156µМ) и полученные растворы оставляют инкубироваться и размешиваться на ночь. В первый раз использовались только нуклеотиды с двумя теломерными повторами Mazh-3. Производилась раститровка на оптимальную концентрацию катионов калия (0.1mМ, 0.3mМ, 0.7mМ и 1М) к количеству олигонуклеотидов на поверхности наночастицы (1/2,1/4,1/16) .
После приготовлении растворов н/ч + olig, где концентрация наночастиц была 5мМ, их прокипятили при температуре 95С в течение 3 минут и затем подв.центрифугированию при 13000g в течение 5 минут. Полученные таким образом наночастицы с «развернутыми» олигонуклеотидами использовались в дальнейших опытах.
Гель-электрофорез днк-модифицированных наночастиц.
Электрофорез ДНК – это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру и форме ( в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки). Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно, следовательно, цепи олигонуклеотидов двигаются от отрицательно заряженного катода, к положительно заряженному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие – быстрее. К образцам добавляется низкомолекулярный кислый краситель (бромфениловый синий). Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором (ЭДТА, трис и борную кислоту ТАЕ и ТВЕ). Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул под действием электрического поля.
Приготовление агарозного геля: раствор агара в воде 0.8% кипятить до полного растворения агара в воде. Остудить. После остужения, раствор залить в подготовленную ёмкость; ждать 15 минут до застывания. Подготовить пробирки: в каждую добавить по 3λ образцов и по 0,6λ красителя (бромфениловый синий). Раствор перенести аккуратно на агаровую поверхность и провести электрофорез. Через некоторое время на агаре появится красный «след» от каждой пробы. Вынуть гель после окончания электрофореза и сфотографировать.
Результаты
Для создания тест-системы было выбрано несколько олигонуклеотидов: Mazh-3, Mazh-4 и рА30 (их последовательности указаны в материалах и методах). Предполагается, что Mazh-3, имеющий два теломерных повтора, образует бимолекулярные G-квадруплексы; Mazh-4, содержащий четыре теломерных повтора, образует внутримолекулярные квадруплексы; рА30 образовывать G-квадруплексы не может, так как представляет из себя последовательность только из аденина. В качестве наночастиц использовались наночастицы золота размером 10-15 нм.
Первым шагом нашего исследования был синтез наночастиц золота, модифицированных G-квадруплекс-образующими олигонуклеотидами. Были приготовлены образцы с модельными олигонуклеотидами в соотношении н/ч к олигонуклеотидам 1/2, 1/4 ... по стандартной методике [6]. Успешность модификации подтвержалась анализом с помощью агарозного гельэлектрофореза.
По результатам разделения в агарозном геле видно, что модификация наночастиц олигонуклеотидами прошла успешно. Видно что при соотношении наночастицы/олигонуклеотиды 1/16 происходит изменение подвижности (полосы 2 и 5 обозначенные на рисунке стрелками) наночастиц при гельэлектрофорезе.
1. 1/2 (соотношение н/ч к олигонуклеотидам – далее для краткости будет приведено просто сооношение без пояснения), 0,1 М (концентрация KCl).
2. 1/2; 0,3M
3. 1/4; 0,1M
4. 1/4; 0,3M
5. 1/16; 0,1M
6. 1/16; 0,3M
7. 1/2; 1M
8. 1/2; 0,7M
9. 1/4; 1M
10. 1/4; 0,7M
11. 1/16; 1M
12. 1/16; 0,7M
13. 0,1 M(далее последние пробы проводились без нуклеотидов: наночастицы с солью – указана концентрация соли)
14. 0,3М
15. 1М
16. 2М
Чтобы увидеть изменение свойств наших модифицированных наночастиц было решено посмотреть при каких концентрациях соли происходит агрегация и найти граничное состояние между выпадением и невыпадением. Были приготовлены пробы с разными концентрациями KCl и разным количеством олигонуклеотидов на частице. С полученных образцов была проведена спектроскопия, по данным которой было выяснено, что оптимальная концентрация катионов – 0.3М.
На схеме отображенны данные по спектроскопии: 1/2 (и проч.) – соотношение наночастиц к олигонуклеотидам; k01 (и проч.) концентрация ионов калия в моль/л.
Одним
из лигандов, который способен
стабилизировать G-квадруплекс,
является 5,10,15,20-тетра(н-метил-4-пиридил)порфирин
или TMPyP
(рис 5). TMPyP
проявляет аффиность к квадруплексам
ДНК и мощно ингибирует теломаразную
активность. Есть данные, что он связывает
снаружи концы анти-параллельных
квадруплексов ДНК, взаимодействуя
своими порфириновыми кольцами с
гуаниновыми тетрадами. Следовательно,
стабилизация анти-параллельных
квадруплексов ДНК и эффективное
ингибирование вызвано п-п стекинг
взаимодействием между ядром порфирина
и гуаниновой тетрадой. [8]
Рис 5. TMPyP
Были приготовлены пробы с разными концентрациями соли и разными соотношениями олигонуклеотидов на поверхности наночастицы (как в предыдущем эксперименте), к ним был добавлен TMPyP.
На диаграмме синим отмечены пробы без стабилизатора, красным – с TMPyP.
Далее были приготовлены новые образцы с наночастицами, но вместо соли был использован TMPyP 20мМ и 5мМ (предотвращение дополнительного высаливания наночастиц солью). При добавлении стабилизатора в высокой концентрации (20мМ) происходило изменение окраски с красного на синий (особенно явно это произошло с модификацией ½), однако после перемешивания осадок растворялся и цвет стал обратно красный. Через некоторое время и на след.день агрегация не наблюдалась.
К сожалению, имеющийся в нашем распоряжении стабилизатор G-квадруплексов вызывает агрегацию наночастиц, предположительно за счет гидрофобных взаимодействий... Поэтому было решено попробовать использовать стабилизирующее влияние некоторых простых катионов.
Наилучшим стабилизатором квадруплексов является K, наихудшим Li. К сожалению, соли влияют на агрегацию наночастиц сами по себе, поэтому мы попытались найти условия, при которых агрегация определялась бы их действием на олигонуклеотиды, а не на сами наночастицы...
Следующая партия образцов была с тремя разными олигонуклеотидами: Mazh-3, Mazh-4, PA30; взятых в соотношении ¼ и 1/16 к наночастице. Далее было приготовлено 12 образцов с разными солями (NaCl, KCl; 0.3M) и разными модифицированными нуклеотидами (Mazh-3, Mazh-4, PA30; ¼,1/16).
С натрием особой стабилизации не происходит. В дальнейшем было решено заменить катионы натрия на литий (rLi+=0.76A, rNa+=1.02A,rK+=1.38A). Вместо NaCl был взят LiCl; с ним проделан аналогичный опыт: 12 образцов с разными модифицированными нуклеотидыми (Mazh-3, Mazh-4, PA30; ¼,1/16) и разными солями (LiCl, KCl; 0.3M); плюс еще пять образцов без соли.
На диаграмме синим выделены образцы с Mazh 4, красным – с pA30, зеленым – с Mazh 3.
С литием агрегации визуально не наблюдалось, однако по спектрам видно, что небольшое выпадение все же есть, но за счет влияния катионов на наночастицы, а не на олигонуклеотиды. Затем было приготовлено 63 образца с разными солями (LiCl, KCl; 0.3M), разными нуклеотидами (Mazh-3, Mazh-4, PA30; ¼,1/16) и разными концентрациями стабилизатора (TMPyP 5M, 20M); плюс контрольные образцы.
На диаграмме красным выделены образцы с pA30, синим – с Mazh 3, зеленым – с Mazh 4.
На диаграмме видно, что наибольшая агрегация произошла с пробами, в которых применятся рА30 (не имеет гуанина). «Защита» наночастиц от выпадения не произошла, так как не образовались квадруплексы. Меньше всего агрегация наблюдается в образцах с Mazh-4 (особенно в образце с соотношением 1/16 н/ч на олиг.). Следовательно, можно предположить, что образовалась, так называемая, «шуба» на поверхности частицы, которая и защищает от выпадения.
Zhuo Du, Yiqiang Zhao and Ning Li (2009), Genome-wide colonization of gene regulatory elements by G4 DNA motifs, Nucleic Acids Research
Gary Nigel Parkinson, Fundamentels of Quadruplex Structures
Tomas simonsson (2001), G-Quadruplex DNA Structures – Variations on a Theme, Biol.Chem.
Tracy A. Brooks, Samantha Kendrick and Laurence Hurley (2010) , Making sense of G-quadruplex and i-motif functions in oncogene promoters, The FEBS Journal
Veronica Gonzalez, Kexiao Guo, Laurence Hurley and Daekyu Sun (2009), Identification and Characterization of Nucleolin as a c-myc G-quadruplex-binding Protein, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
Shelley A. Claridge, Alexander J. Mastroianni, Yeung B. Au, Huiyang W.Liang,Christine M. Micheel, Jean M. J. Frechet, and A. Paul Alivisatos (2008); Enzymatic Ligation Creates Discrete Multinanoparticle
Building Blocks for Self-Assembly, Jacs Articles.
Anne De Cian, Laurent Lacroix, Celine Douarre, Nassima Temime-Smaali,
Chantal Trentesaux, Jean-Francois Riou, Jean-Louis Mergny (2008); Targeting telomeres and telomerase, Biochemie.
Yoshinobu Ishikawa, Yoshikazu Tomisugi and Tadayuki Uno (2006); Molecular modeling of anti-parallel G-guadruplex DNA/TMPyP complexes; Nucleic Acids Symposium Series
Jiasi Wang , Li Wu , Jinsong Ren , and Xiaogang Qu (2011), Visualizing Human Telomerase Activity with Primer-Modified Au Nanoparticles