Конъюгация антител с пероксидазой хрена периодатным методом Реактивы

• Пероксидаза хрена RZ=3

• 0,1 М раствор периодата натрия

• 1 мM натрий-ацетатный буфер, рН 4,4.

• 0,2 М Na₂CO₃

• 5-10 мг антител в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5

• 0,4% раствора боргидрида натрия

• 0,01 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 М NaCl

Ход работы

• Для приготовления коньюгата использовали ~2,1 мг антител к ЛФ и ~1,7 мг антител к МПО , растворенных в 6 и 9 мл 0,05 М натрий карбонатном буфере, рН 9,5 соответственно.

• На 1 мг антител брали 1,2 мг пероксидазы хрена: ~5,7 мг пероксидазы хрена. Пероксидазу растворяли в 1 мл воды и добавляли 1,3 мл 0,1 М раствора периодата натрия, перемешивали 20 минут на мешалке и проводили диализ в течение ночи при +4°С против избытка 1 мM натрий-ацетатного буфера, рН 4,4. V раствора пероксидазы ~3 мл после диализа.

• К смеси прибавляли 20 мкл 0,2 М Na₂CO₃, затем сразу же раствор антител, предварительно диализованный против 0,05 М натрий-карбонатного буфера, рН 9,5: к 1,5 мл активированной пероксидазы хрена 7,5 мл антител к ЛФ (0,31 мг/мл) и к 1,5 мл активированной пероксидазы хрена 10 мл антител к МПО (0,23 мг/мл). Смесь инкубировали 2 часа на роторной мешалке при комнатной температуре.

• Далее к смеси прибавляли 100 мкл 0,4% раствора боргидрида натрия и инкубировали 2 часа на роторной мешалке при +4°С.

• Конъюгат подвергали диализу течение ночи при +4°С против 0,01 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl.

Результаты.

После диализа конъюгатов (антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена):

1. конъюгаты АТ к ЛФ*ПХ 10 мл

2. конъюгаты АТ к МПО*ПХ 13 мл

Эти конъюгаты будут использованы далее в методе ИФА «Elisa», в иммуноцитохимии.

Заливка гелей, электрофорез, электроперенос Ход работы Заливка гелей

Приготавливали 50 мл разделяющего геля. Для этого брали 10,5 мл раствора акриламида и N,N’-метиленбисакриламида (48% акриламид и 1,9% бисакриламид), 500мкл 10 % SDS (для этого растворили 2гр SDS в 20 мл воды), 25 мл 0,75 М трис-HCl (pH 8,8), 14 мл воды. Затем к полученному раствору добавляли 25 мкл ТЕМЕД (до конечной концентрации 0,05%) и 30 мг PSA (до конечной концентрации 0,06%) и заливали в камеру для заливки на 6 гелей. Сверху наслаивали воду. Через 20 минут остатки геля в стакане заполимеризовались.

Через 30 минут приготавливали 15 мл разделяющего геля. Для этого брали 935 мкл упомянутого выше раствора акриламида и бисакриламида, 150 мкл 10% SDS, 3,75 мл 0,5 М трис-HCl (pH 6,8), 10,25 мл воды. Затем сливали наслоенную на заполимеризовавшийся разделяющий гель воду, добавляли к раствору для концентрирующего геля 7,5 мкл ТЕМЕД (до конечной концентрации 0,05%) 10 мгр PSA (до конечной концентрации 0,067%) и заливали концентрирующий гель. После чего вставляли гребёнки для формирования лунок для нанесения проб.

Приготовление и нанесение проб.

Приготавливали пробы. Для приготовления трёхкратного раствора для проб, к 500 мкл буфера (8 % SDS, 1 М трис-HCl (pH 6,8) добавляли 60 мкл 1М DTT). Затем к 30 мкл трёхкратного раствора для проб добавляли 60 мкл белковой пробы (молока коровы, козы, человека, стандартных растворов миелопероксидазы и лактоферрина, слёз, слюны и трёх экстрактов лейкоцитов). Для приготовления пробы с маркерами молекулярных весов для последующей окраски геля, к 1 мкл маркеров добавляли 20 мкл однократного раствора для проб. Затем все пробы инкубировали 7 минут в только что закипевшей воде.

Через 2 часа гребёнки вынимали, промывали лунки для нанесения проб водой. Собирали электрофоретическую камеру.В верхнюю камеру (внутреннюю) наливали приблизительно 125 мл электродного буфера (0,025 М трис-глициновый буфер (pH 8,3) с 0,1% SDS), так, чтобы граница буфера была выше верхнего края короткого стекла.

В нижнюю камеру заливали приблизительно 200 мл буфера. После чего наносили пробы в следующем порядке: 10 мкл молока коровы (CM), 10 мкл молока козы (GM), 10 мкл молока человека (HM), 10 мклстандартных растворов миелопероксидазы или лактоферрина (ст), 10 мкл маркеров на окраску геля (или 7 мкл маркера на перенос) (М) 10 мкл слёз (Ё), 10 мкл слюны (Ю) и по 10 мкл трёх экстрактов лейкоцитов (Э1-Э3). В процессе нанесения в пробы добавляли следовые количества бромфенолового синего.