- •1. Введение
- •2. Основные термины и определения
- •3. Роль регуляторных механизмов в поддержании клеточного гомеостаза
- •4. Типы регуляции
- •5. Практическое использование знаний об основах регуляции метаболизма у микроорганизмов
- •1. Способ регуляции метаболических процессов, основанный на избирательном синтезе ферментов
- •2. Регуляция репликации днк
- •3. Регуляция процесса транскрипции. Механизмы индукции и репрессии
- •4. Другие механизмы регуляции транскрипции у микроорганизмов
- •1. Избирательный синтез ферментов за счет регуляции процесса трансляции у микроорганизмов
- •2. Биосинтез и сборка компонентов аппарата трансляции
- •3. Регуляция функционирования аппарата трансляции
- •4. Способы регуляции биосинтеза и круговорота белков у микроорганизмов путем посттрансляционной модификации и избирательного протеолиза
- •1. Способ регуляции метаболических процессов у микроорганизмов, основанный на изменении активности ферментов
- •2. Простые и регуляторные ферменты
- •3. Аллостерические ферменты и эффекторы
- •4. Гомотропная и гетеротропная кооперативность
- •5. Обратимая ковалентная модификация
- •1. Специфические механизмы регуляции активности ферментов у микроорганизмов. Регуляция путей биосинтеза и промежуточного обмена
- •2. Роль энергетического заряда в регуляции клеточного метаболизма
- •3. Регуляторные эффекты Пастера и Крэбтри
- •4. Регуляция метаболической активности за счёт компартментализации ферментов и их взаимодействия с клеточными мембранами
- •1. Пассивная проницаемость и транспортные функции цитоплазматической мембраны бактерий
- •2. Энергетика транспортных процессов у микроорганизмов
- •3. Организация и регуляция транспортных процессов на уровне биосинтеза. Сборка и функционирование компонентов транспортных систем
- •1. Общая характеристика процесса клеточного деления
- •2. Накопление критической клеточной массы и репликация днк генома
- •3. Построение клеточной оболочки и перегородки
- •4. Взаимоотношение репликации днк и сборки клеточной перегородки
- •1. Скорость метаболизма в процессе клеточного деления
- •2. Выявление «узких мест» в метаболизме микробной клетки
- •3. Связь скорости роста микроорганизмов с биосинтезом стабильных форм рнк
- •4. Взаимосвязь регуляторных механизмов и их реализация в развивающихся микробных клетках
- •5. Регуляция межклеточных взаимодействий
- •1. Общая характеристика методологических подходов к решению научных проблем регуляции метаболизма микробных клеток
- •2. Классификация методов изучения регуляции метаболической активности
- •3. Методические особенности изучения скорости роста и активности транспортных систем у микроорганизмов
- •4. Методы изучения регуляции клеточного метаболизма с использованием мутантных микроорганизмов
- •Практика
- •Вводная часть
- •Основные термины и определения
- •1 Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2 Изучение метаболической активности микроорганизмов. Общая характеристика условий эксперимента
2 Изучение метаболической активности микроорганизмов. Общая характеристика условий эксперимента
Методы определения метаболической (ферментативной) активности микроорганизмов должны быть по возможности точными, чувствительными, непрерывными, удобными и специфическими для изучаемых реакций. Однако чаще всего выполняются далеко не все эти требования. Поэтому, прежде чем признать метод пригодным для использования, необходимо провести многочисленные контрольные и стандартные тесты..
В большинстве случаев для определения активности ферментов каждого определенного вида микроорганизма нужны специальные условия. Нельзя применять один и тот же метод для изучения ферментов одного типа у различных видов бактерий. От вида к виду могут сильно различаться потребности бактерий в ионах и кофакторах, оптимумы рН и температуры, значения Км, чувствительности к ингибиторам и равновесия реакций.
Если в неочищенном экстракте ферментативная активность не обнаруживается, это еще не означает, что организм, из которого приготовлен экстракт, не содержит этот фермент. Частичная или полная потеря активности фермента, присущей данному микроорганизму, может произойти во время приготовления экстракта. Внутри клетки фермент защищен от инактивации оксидантами и другими веществами окружающей средой и многочисленными белок-белковыми взаимодействиями, которые нарушаются в результате разрушения клеток.
Важно учитывать влияние концентрации белка на активность фермента при изучении регуляторных ферментов.
Также фермент может присутствовать в экстракте, но не проявлять активность, пока в реакционную смесь не будут внесены недостающие компоненты или из нее не будут удалены ингибиторы его активности.
Помимо всего прочего, рекомендуется проводить контрольный эксперимент, добавляя к исследуемой смеси экстракт клеток, заведомо содержащий интересующий фермент.
Комиссия по ферментам Международного биохимического союза рекомендует во всех случаях считать единицей ферментативной активности количество микромолей субстрата, потребляемого в 1 мин (или продукта, образующегося в 1 мин). На практике, однако, активность ферментов часто выражают в других единицах. Однако, где это возможно, следует использовать активность ферментов в международных единицах.
Невозможно описать подробно все многочисленные способы определения различных ферментов. Достаточно сказать, что анализ может быть непрерывным, когда за реакцией наблюдают, не нарушая ее хода, или периодическим, т.е. связанным с периодическим отбором проб для измерения потребления субстрата или образования продукта. Предпочтительнее, однако, применять метод с периодическим отбором проб. Его осуществляют с помощью самых разнообразных способов, включая спектрофотометрический, манометрический, полярометрический и хроматографический. Проводят измерения также с помощью электродов и с использованием широкого набора химических агентов и изотопов.