58.Опыты по трансплантации ядер. Методы клонирования генетически идентичных организмов.

Энуклеация (enucleation) - Удаление ядра из клетки – один из методов (наряду с трансплантацией ядер) анализа взаимодействия ядра и цитоплазмы. В качестве объекта энуклеации часто используют амеб, клетки зародышей земноводных и др.

Клонирование — это получение генетически идентичных особей взрослого организма, т. е. бесполое размножение генетически идентичных живых существ с целью создания точных двойников одного и того же индивидуума. Можно выделить три метода клонирования.

Первый метод — разрезание эмбриона на половинки или четвертинки. Практикуется давно. Таким путем были получены особи разных видов млекопитающих — мышей, коров, овец, лошадей. Недостатком этого метода является то, что более чем на четыре части эмбрион разрезать не удается. И если жизнеспособность половинок эмбриона практически не отличается от жизнеспособности целых зародышей, то выживаемость четвертинок существенно ниже.

Второй метод основан на пересадке ядер эмбрионов в лишенные собственного генетического материала клетки. Если, к примеру, использован эмбрион, состоящий из 16 клеток, то в идеальном случае можно получить 16 новых генетически идентичных эмбрионов. Эти эмбрионы могут быть возвращены в половые пути самки для получения генетически идентичных взрослых особей.

Третий метод — использование в качестве генетического материала ядер соматических клеток взрослой особи и пересадка их в яйцеклетку, лишенную собственного генетического материала. Но здесь возникают определенные проблемы. Во-первых, клетка взрослого организма уже завершила свое развитие, и не совсем понятно, можно ли ее «перепрограммировать». Во-вторых, нужно как-то синхронизировать развитие двух клеток — соматической (несущей ядро) и яйцеклетки без клеточного ядра.

Клонирование как способ получения генетически идентичных копий животных из соматических клеток взрослого организма было мечтой нескольких поколений генетиков. Первым прорывом в этом направлении по праву можно считать создание Долли.

Возможность клонирования эмбрионов позвоночных впервые установили в начале 50-х годов в опытах на амфибиях, а уже в начале 90-х была решена и проблема клонирования эмбриональных клеток млекопитающих.

59.Тканеспецифическая активность генов. Функциональные изменения хромосом в онтогенезе (пуффы, «ламповые щетки»); роль гормонов, эмбриональных индукторов.

Тканеспецифические гены, определяющие особенности клеточной дифференцировки, испытывают давление системы других генов, контролирующих их функции. Эти гены можно разделить на регуляторные, временные и "архитектурные". Рассмотрим, как они работают, на примере проявления в семявыносящей луковице самцов Drosophila virilis (один из хорошо генетически изученных видов рода Drosophila) гена, кодирующего тканеспецифичес-кий изофермент (фракцию фермента) эстеразы. Этот изофермент, попадая в половые пути самки при оплодотворении, расщепляет в них цис-вакце-нилацетат с образованием феромона - пахнущего продукта, который "сообщает" самцам, что данная самка больше не нуждается в их услугах.

Из рис. 4 видно, что уровень активности структурного гена этой эстеразы, который локализован во 2-й хромосоме, зависит от сигналов, поступающих от регуляторного гена, разместившегося в половой Х-хромосоме. Он определяет, сколько молекул мРНК будет синтезировано в клетке (как это предусмотрел в своей модели Морган). Однако (как это предусмотрел в своей модели Гольдшмидт), хотя мРНК синтезируется и транспортируется в цитоплазму клетки, синтез фермента не начинается, пока не поступит сигнал от другого гена, гена "времени", который расположен в 4-й хромосоме и от которого зависит момент начала синтеза молекул эстеразы на матрицах мРНК.

Что же это за сигнал? По предварительным данным, это одна из транспортных РНК, несущих аминокислоты к месту синтеза белка, она оказалась особенно нужной для синтеза изофермента "нашей" эстеразы. Однако молекулы изофермента, которые синтезируются в клетке, могут находиться там либо в свободном, либо в связанном с белками клеточных мембран состоянии. У разных линий и видов мухи соотношение "свободной" и связанной с мембранами фракций может быть различным; оно определяется специальным "архитектурным" геном, отвечающим за синтез определенного белка, встроенного в эти мембпаны.

Итак, процесс генетической регуляции клеточной дифференцировки очень сложен, и существует система генов, от которой зависит синтез тканеспе-цифических продуктов.

Хромосомы типа "ламповых щёток" формируются в течение исключиттельно протяжённого по времени мейотического деления, которое может продолжаться до нескольких месяцев. В течение этого времени хромосомы пребывают в сильно декомпактизованном состоянии и могут наблюдаться под световым микроскопом. На более поздних стадиях мейоза хромосомы становятся компактными. Общая длина набора хромосом "ламповых щёток" составляет 5-6 мм.Хромосомы этого типа были открыты Вальтером Флеммингом в 1878 году. Каждая из хромосом - "ламповых щеток" состоит из двух хроматид. Материал петли выходит из одного хромомера и входит в соседний, а затем эти хромомеры сливаются в один в нерастянутой хромосоме. Т.о., петля является межхромомерным промежутком хромосомы.Две петли, выходящие из одной и той же пары хромомеров, являются по сути двумя хроматидами. Это очень хорошо видно на растянутой хромосоме Каждая петля имеет довольно сложное строение: она имеет - хроматиду, окруженную накопленными продуктами активности.От начала до конца петли накопление продуктов происходит асимметрично. На одном конце их почти нет, на другом - максимальное количество. По характеру накопления материала петли могут сильно различаться .Найдено несколько типов распределения участков транскрипции в петле ."Классический" тип - это когда матрикс располагается по длине всей петли. При этом ясно различаются толстый и тонкий конец петли, матрикс постепенно увеличивается в толщине от тонкого конца к толстому. Достигнув максимальной толщины, более не увеличивается.Производным этого типа организации является следующий:транскрипционная единица в петле расположена также полярно, однако в ее начале и конце расположены нетранскрибируемые участки. Если петли, включающие две или более транскрипционных единиц ротивоположной полярности, расположенных либо "голова к голове"(под головой понимается точка начала транскрипции), или "хвост к хвосту" (под хвостом понимается участок терминации транскрипции) По результатам гибридизации различных последовательностей ДНК показало, что некоторые гены полностью занимают участки транскрипционной активности в петлях. В петлях транскрибируются сателлитные ДНК. Сателлитная ДНК, состоящая из повторенных фрагментов гибридизуется с гигантской петлей,имеющей единственную транскрипционную единицу. Интересно, что гибридизация выявляется, если препарат предварительно не обрабатывали РНК-азой и ДНК на нём не денатурировали. Это свидетельствует о том, что данная сателлитная ДНК транскрибируется в хромосомах типа "ламповых щёток". Сателлит состоит из 330 п.н. Он транскрибируется во многих петлях в ооците. Транскрипты находят в цитоплазме ооцита. Пуфы являются районами хромосом, в которых гены находятся в активном состоянии, т.е. разрыхление материала диска и формирование из него специфического пуфа – является морфологическим проявлением активирования гена и коррелирует с определенным состоянием дифференцировки. Разрыхление материала диска связано с тем, что в области активируемого гена происходит сначала накопление различных белков, входящих в транскрипционные комплексы, затем из-за накопления вновь синтезируемой РНК и белков, упаковывающих эту РНК в специфические гранулы, в составе которых она транспортируется из ядра в цитоплазму.В 1961 году В. Беерман нашел корреляцию между появлением особых гранул секреции в клетках особой доли слюнной жеелезы и активностью дополнительного Кольца Бальбиани в клетках этой доли. Таким образом впервые была обнаружена связь между активностью пуфа и продукта, синтезируемого клеткой.За последние 10 лет выведена и клонирована ДНК примерно двух десятков пуфов. Эта ДНК, как оказалось, содержит гены, имеющих очень большую протяженность - 50-120 т.п.н. В составе генов многочисленные экзоны, вступающие в альтернативный сплайсинг, и очень длинные (до 40 т.п.н.) интроны