1.3 Титрование вирусов с использованием фрагментов эмбрионов

Использование фрагментов эмбрионов, т. е. кусочков скорлупы 11-дневных оплодотворенных яиц с присоединенной к ним хорионаллантоисной оболочкой, вместо целых эмбрионов лежит в основе весьма экономичного способа определения инфекционное™ препаратов, содержащих вирус гриппа. Данный метод, предложенный для титрования вируса гриппа еще до введения в практику культур клеток, и теперь весьма полезен для титрования штаммов вирусов, не размножающихся в культуре клеток или при отсутствии подходящей культуры.

Использование фрагментов хорионаллантоисной оболочки вместе со скорлупой существенно, поскольку скорлупа помогает сохранить ткань неповрежденной и действует как мощная буферная система, поддерживающая рН 7,5.

Получение фрагментов эмбрионов

1. Острые концы оплодотворенных 11-дневных яиц вскрывают ножницами и извлекают эмбрион. Если вместе с эмбрионом извлекается хорионаллантоисная оболочка, такое яйцо следует отбросить.

2. Скорлупу с оболочкой 2 раза промывают стандартной средой, и нарезают на продольные полоски шириной около 0,6 см. Эти полоски в свою очередь разрезают на квадратные кусочки.

3. Кусочки скорлупы хранят в чашках Петри со стандартной средой, Из каждого яйца можно получить до 100 квадратных кусочков площадью 6 мм.

Заражение фрагментов эмбрионов

1. Титрование можно проводить в небольших реакционных пробирках или, что более удобно, в планшетах для гемагглютинации.

2. Планшеты стерилизуют 95%-ным этанолом. Избыток этанола удаляют и заворачивают каждый планшет отдельно в стерильную бумагу. Планшеты выдерживают в термостате в течение ночи для полного испарения этанола. После этого планшеты готовы к использованию.

3. Фрагменты эмбрионов помещают в планшеты и добавляют в каждую лунку по 0,3 мл стандартной культуральной среды. Инкубация фрагментов эмбрионов при комнатной температуре в течение нескольких часов или при 37°С в течение 24 ч при перемешивании не влияет на последующее размножение вируса.

4. Готовят последовательные 10-кратные разведения исследуемого вируса и вносят в лунки по 0,025 мл каждого разведения.

Инкубация образцов

1. При исследовании большого числа вирусных образцов планшеты ставят стопкой один на другой, сделав между ними прокладки толщиной 0,3 см, для обеспечения эффективной аэрации.

2. Стопку планшетов помещают на подходящую подставку и окружают влажной ватой.

3. Всю конструкцию фиксируют клейкой пленкой или алюминиевой фольгой, помещают в термальную комнату и интенсивно встряхивают 2—3 сут в зависимости от исследуемого штамма вируса. Рекомендуется использовать горизонтальный шейкер. Интенсивное встряхивание позволяет избежать накопления токсичных метаболитов и обеспечить эффективную аэрацию клеток.

Учет результатов

По окончании инкубации из лунок планшета пинцетом с тонкими концами удаляют фрагменты эмбрионов и вносят в каждую лунку по 0,25 мл стандартной 1%-ной суспензии эритроцитов. Планшеты быстро встряхивают и оставляют на 30 мин на белом фоне. Гемагглютинация свидетельствует о размножении вируса. Титр вируса определяют так же, как и при использовании целых эмбрионов.

Приготовление стандартной среды

Готовят следующие навески: NaCl —8,0 г КС1 — 0,6 г СаСЬ —0,8 г MgCl₂ — 0,05 г Глюкоза — 0,3 г

Желатин —2,0 г

Хлорамфеникол — 0,1 г К навескам добавляют нейтральный красный и воду — до 1 л. рН доводят приблизительно до 7,0, добавляя несколько капель 1 Н NaOH. Нейтральный красный действует как индикатор; при рН 7,0 раствор должен иметь желто-оранжевую окраску. Раствор стерилизуют автоклавированием 30 мин при 115°С.