2. Методы лабораторной диагностики урогенитальных хламидиозов.

Основные принципы диагностики хламидийной инфекции - те же, что и при другой бактериальной патологии. Тестовые процедуры включают в себя:

1. прямую визуализацию агента в клинических образцах при окраске (бактериоскопический метод)

2. определение специфических хламидийных антигенов в клиниче­ских образцах

3. непосредственную изоляцию из тканей больного (бактериологи­ческий метод)

4. серологические тесты, при которых определяются антитела (демон­страция изменяющихся титров)

5. определение специфических хламидийных генов в клинических образцах.

2.1. Бактериоскопический метод

Принцип метода Бактериоскопические исследования предполагают выявление морфологических структур хламидий в пораженных клетках (клиническом материале).

Материально-техническое обеспечение метода.

Материалом для исследования служат соскобы с доступных иссле­дованию слизистых оболочек мочеполовых органов (уретра, шейка мат­ки, влагалище), а также конъюнктивы, прямой кишки и др., при экстрагенитальных формах.

Методика.

Соскобы со слизистых оболочек мочеиспускательного канала и шей­ки матки берут ложкой Фолькмана, специальной щеточкой или зондом, соблюдая правила антисептики. Выделения и слизистую пробку цервикального канала удаляют тампоном. Соскобы из глубины уретры и цервикального канала осуществляют со всех четырех квадрантов. В мате­риале должны присутствовать эпителиальные клетки. Присутствие вы­делений и примесей крови маскируют хламидий и затрудняют диагности­ку. При экстрагенитальных поражениях соскобный материал получают аналогичным способом.

Взятый материал распределяют тонким слоем на поверхности обез­жиренного предметного стекла, подсушивают и фиксируют. Мазки окра­шивают по Романовскому - Гимза. При окраске по Романовскому-Гимза необходимо обнаружение в соскобном материале цитоплазматических включений хламидий (тельца Гальбедштедтера-Провачека). Включения содержат крупные ретикулярные тельца, которые окрашиваются по Романовскому-Гимза в синий цвет, и мелкие элементарные тельца, окра­шивающиеся в фиолетово-красный. Включения по цвету и внутренней структуре отличаются от ядра клетки и цитоплазмы. Они располагаются в виде "шапочки" около ядра. На ранних стадиях развития включения могут быть 2-5мкм диаметром, зрелые включения увеличиваются в раз­мерах и могут занимать всю цитоплазму, оттесняя ядро на периферию клетки-хозяина. Для постановки диагноза хламидийной инфекции доста­точно обнаружить одно типичное цитоплазматическое включение.

Показания и противопоказания метода.

При диагностике урогенитального хламидиоза метод исследования мазков, окрашенных по Романовскому-Гимза, характеризуется сравни­тельно низкой чувствительностью (10-20%) и редко применяется в на­стоящее время. Рекомендуется использование при конъюнктивите ново­

рожденных и острых глазных инфекциях взрослых, когда чувствитель­ность этого метода составляет 90-100%.

2.2.Выявление антигенов в клинических образцах.

2.2.1. Метод люминесцирующих антител.

Принцип метода.

Бактериоскопические исследования предполагают выявление анти­генов хламидий в пораженных клетках (клиническом материале).

В рутинной лабораторной практике можно использовать как прямой (ПИФ), так и непрямой иммунофлуоресцентный методы (НИФ). Первый метод предполагает обработку препарата непосредственно специфиче­скими моно- или поликлональными антителами, меченными флюоресцеином, при использовании второго препарат обрабатывается сначала иммунной сывороткой, содержащей немеченые антихламидийые анти­тела, а затем антивидовой флуоресцирующей сывороткой.

Материально-техническое обеспечение метода.

Люминесцентный микроскоп

Холодильник бытовой

Термостат

Пипетки дозаторные

Предметные стекла

Карандаш по стеклу

Моноклональные или поликлональные антитела к хламидиям

Масло иммерсионное не флюоресцирующее

Контрольные препараты, содержащие и не содержащие хламидий (положительный и отрицательный контроль).

Инкубационная камера для препаратов

Ацетон

Спирт

Эфир

В настоящее время выпускается ряд отечественных и импортных ком­мерческих тест-систем с использованием меченных флюоресцеином моноклональных антихламидийных антител, такие как "ХлаМоноСкрин" и «ХлаМоноСкрин-2» (ЗАО «Ниармедик Плюс»), MicroTrak (Syva,), Ch.trachomatis IFA (Medac GmbH, Германия), а также тест-система с ис­пользованием меченых флюоресцеином поликлональных антихламидий­ных антител - Хламислайд (ЛАБдиагностика).

Методика.

Методика обработки препаратов излагается в инструкциях, прилагаю­щихся к тест-системам. Высушенные на воздухе препараты фиксируют охлажденным (4°С) ацетоном в течение 10 мин., покрывают раствором флюоресцирующих антител (25-50 мкл), инкубируют во влажной камере при температуре, указанной в инструкции, промывают 2 раза по 5 мин. фосфатно-солевым буфером (NaCI - 6,8г; КН₂РО₄ - 0,63г; Na₂HPO₄ - 1,48г на 1л дистиллированной воды, рН 7,2). После высушивания препарат исследуют в люминесцентном микроскопе. Для длительного хранения или при невозможности просмотра ex tempore препарат монтируют по­кровным стеклом на каплю забуференного глицерина (9 частей глицери­на + 1 часть 0,01М Na₂HPO₄, рН 8,5). Хранить препарат до просмотра можно в холодильнике при 4°С сроком до 1 недели.

Просмотр осуществляют в люминесцентном микроскопе с возбуж­дающими фильтрами ФС1-2, БС8-2 и запирающим фильтром СЗС24-4. При использовании не флюоресцирующего иммерсионного масла уве­личении объектива 90х, окуляра 7х. Можно также пользоваться водноиммерсионным объективом 60х и окуляром 5х.

Коммерческие препараты моно- или поликлональных антител обыч­но содержат синьку Эванса или родамин, которые элиминируют неспе­цифическое свечение и окрашивают цитоплазму клеток в красный или оранжевый цвет. При просмотре мазков эпителиальных клеток антиге­ны хламидий выявляются на красном или оранжевом фоне цитоплазмы эпителиальных клеток или на темном фоне препарата в виде единичных ярко-зеленых ЭТ и РТ. Значительно реже встречаются внутриклеточные включения в виде околоядерных «шапочек» зеленого цвета. Согласно инструкции фирм-изготовителей, для постановки положительного диаг­ноза необходимо обнаружение не менее 10 ЭТ или РТ либо одного ти­пичного внутриклеточного включения.

Показания и противопоказания метода.

Метод люминесцирующих антител для определения антигенов хла­мидий в материале больного применяется в популяциях с высокой сте­пенью риска. Контроль излеченности методом люминесцирующих анти­тел следует проводить не ранее, чем через 3-4 недели после окончания приема антибиотиков, так как возможно получение ложноположительных результатов при недостаточно быстрой элиминации антигенных детер­минант хламидий, содержащихся в составе фрагментов разрушенных клеток. Особые трудности вызывает истолкование результатов анализа в случае обнаружения единичных хламидийных клеток. Мы считаем, что в случае первичного выявления единичных хламидийных ЭТ или РТ при отсутствии клинических симптомов желательно повторить исследование либо получить подтверждение результатов с помощью метода молекулярно-биологической диагностики (наиболее распространенным является метод полимеразной цепной реакции ПЦР). При выявлении единичных хламидийных клеток после лечения следует провести посев материала на культуре ткани, либо, при недоступности лаборатории культуральной диагностики, проводить анализ методом ПИФ, НИФ или ПЦР с интерва­лом 1-2 месяца.

Метод ПИФ и НИФ менее чувствителен, чем выделение в культуре ткани, но обладает высокой специфичностью. Применение коммерческих диагностических наборов, содержащих люминесцирующие моноклональные антитела к родоспецифическим (ЛПС) и видоспецифическим (ОБНМ) антигенам хламидий в соскобных препаратах урогенитального тракта значительно увеличивает чувствительность бактериоскопического мето­да. Она составляет 70-75% для цервикальной инфекции, несколько ниже - 60-70% для уретральной инфекции у мужчин. Специфичность около 98%. К положительным качествам метода люминесцирующих антител относится быстрота исполнения, высокая специфичность. Положитель­ные результаты ПИФ и НИФ не требуют подтверждающих тестов. Недос­татком является некоторый субъективизм оценки, необходимость квали­фицированного микроскописта, осуществляющего просмотр, невозмож­ность автоматизации.