Глава 11. .

ЗООБИОТЕХНОЛОГИЯ

Зообиотехнология является ветвью биотехнологии. Принципи- альное отличие ее от микробной биотехнологии и фитобиотехно- логии состоит в том, что объектами зообиотехнологии являются клетки животных и человека. Наипростейшими животными суще- ствами клеточной организации являются протозойные организмы, или Рго1охоа (от греч. ргоюз — первый, кооп — животное, живое существо), составляющие самостоятельный отдел в царстве Аштала (таблица 55).

Таблица 55. Представители царства АпипаМа

п/п	Отдел	Типы или классы
1	РгсЛогоа (простейшие)	Типы: АсапШапае — акантарии, А5се1озрога — асцетоспоровые, СШорпога — реснитчатые, ' СпЫоБропйа — книдоспоридевые, МабНдорпога — жгутиконосцы, Мгсговропйа — микроспоридевые, ОраНшйотогрпа — опалинидоформные, 5агсосНпа — ложноножки, 5рогогоа — споровики.
2	Рагагоа (губки)	Классы: Са1сагеа — известковые губки, Ретовропсрае — обыкновенные губки, НехасИпеШйа — кремниевые шестилучевые губки.
3	Ме1агоа (многоклеточные гетеротрофные животные)	Типы: Аппеийа — кольчатые черви, АгШгорода — членистоногие, СЬогсЫа — хордовые, Сое1еп1ега1а — кишечнополостные, ЕсЬтос1егта1а—иглокожие, МоЦивса — моллюски, или мягкотелые, Ыета1ос1а — круглые черви, Р1а1упе11шп(:пев •— плоские черви.

Из 65 тысяч видов РпЛохоа 55 тысяч являются свободно живу- щими в природе, а 10 тысяч ведут паразитический образ жизни.

Среди выделяемых ныне 9 типов простейших организмов жгутиковым отводят место пограничных существ, являющихся ближайшими предками многоклеточных животных и растений и образующих мост между ними.

Поддержание Рго1охоа в культуре - дело достаточно сложное, однако многие виды удается выращивать на относительно простых средах или на более сложных, рекомендованных для культивиро- вания клеток и тканей животных (например, среда № 199 и др.). Для некоторых протозойных видов целесообразно добавлять в среды споровые бактерии (Вас. виМШв) и/или дрожжи (Засспаготусев сегеУ151ае и др.). Это обусловлено их фагоцитарной активностью.

С биотехнологических позиций попеременный интерес был проявлен к препаратам круцин (Н. Г. Клюева, Г. И. Роскин) и его аналогу — трипанозе (Ж. Кудер, Ж. Мишель-Брэн и др.), получа- емым с помощью Тгураповота (ЗсЫгоггурапит) спш, астазилиду (Н. Н. Сухарева-Немакова) — полусинтетическому продукту, вклю- чающему комплекс эфиров сахарозы и жирных кислот, выделен- ных из жгутиконосца А51а81а 1опда, полисахаридам. В доклиниче- ских и клинических испытаниях они проявляли больший или меньший противоопухолевый эффект. Однако из-за нестабильно- сти клинических результатов, неосвоенности крупномасштабного культивирования Рго1охоа и некоторых других причин зообиотех- нологий в этом разделе мало продвинулась вперед.

Из всех других представителей царства животных наибольший интерес представляют хордовые. Их подразделяют на два подтипа — бесчерепные (Рго1осЬогаа1а, или Асгаша) и черепные, или позвоночные (Сгашатл, или Уегт.еЪга1а), Всех черепных объединяют в следующие классы: Сус1ов1ота1а (круглоротые), Р1есе8 (рыбы), АгпрЫЫа (земноводные), КерШа (пресмыкающиеся), Ауев (птицы) и МаттаИа (млекопитающие).

Значимость представителей царства животных в зообиотехно- логии далеко неравноценная. Это связано с теми обстоятельствами, что во многих случаях еще не разработаны способы культивиро- вания клеток не только в производственных, но и в лабораторных условиях, или, как говорят, "еще не дошли руки" до конкретных биообъектов животного происхождения, хотя техника однослой- ной культуры клеток впервые разработана еще в 1950 г. Ф. К. Роббинсом и Дж. Ф. -Эндерсом.

533

В настоящее время в промышленном масштабе освоены лим- фобласты человека, продуцирующие интерферон, клетки-гибри- домы, образующие моноклональные антитела; монослойные кле- точные культуры различных тканей, использующиеся, например, для репродукции вирусов и т. д. Даже из этих немногочисленных примеров можно заключить, что первостепенной задачей для зообиотехнологических процессов является получение клеток и клеточных культур.

11.1. Способы выращивания клеток животных. Любые клетки животного организма происходят из оплодотворенной яйцеклетки, которая со временем развивается и дифференцируется (рис. 151).

Зародышевый диск вклю- чает эктодерму, эндодерму и мезодерму, из которых впоследствии образуются все ткани макроорганизма. Но как только какую-либо ткань перевести в культу- ру, то наступает дедиффе- ренциация клеток и разли- чить их становится делом трудным или невозмож- Рис. 151. Эмбрион млекопитающего на ран- _НЫм_{( и} поэтому регистра- ней стадии развития: 1 — зародышевый диск, 2 ц_ИЮ цх ведут ПОЧТИ ИСКЛЮ- — эктодерма. 3 — эндодерма. 4 — первичнвя _{чительно} по происхожде- мезодерма, 5 - трофобласт. _нию Например, для иссле-

дования в области онкологии важны культуры раковых клеток, о которых имеются сообщения в научной литературе. Такие клетки получены от больных раком легкого и щитовидной железы. В 1986 г. в Японии впервые получен в культуре штамм клеток рака желчного пузыря. Он был стабилен после 103 пассажей ш лагго, сохранил прежнее число хромосом в пределах 76—101. Индуциру- емый им опухолевый процесс и первичный рак желчного пузыря оказались тождественными по гистограмме. Подобный штамм оказался полезным при оценке противоопухолевых средств.

Любой штамм, представляющий определенную ценность для научно-практического использования, должен иметь следующие характеристики:

1) качество исходной ткани - нормальная или опухолевая (для опухолевой необходим показатель доброкачественности или злтр качественности),

2. тип ткани — эмбриональная или зрелая,

3. принадлежность ткани — вид животного,

4. источник ткани — орган,

5. тип клетки (если известно),

6. наименование штамма (буквенное — не более 4 букв и серия цифр нумерации),

7. номер клона, если штамм клонировался,

8. источник информации (ссылка на оригинальную публика- цию).

Все способы выращивания клеток животных могут быть соот- несены либо к интактным (нетрансформированным с помощью вирусов), либо к вирусотрансформированным клеткам. Успех куль- тивирования первых во многом обусловлен наличием и плотностью адгезинов, благодаря которым они проявляют эффект "заякорива- ния" на подлежащей поверхности стекла, металла или пластика. Однако такие клетки не растут в суспензионных культурах.

Вирусотрансформированные клетки животных, напротив, хо- рошо растут в виде суспензионных культур и хуже или совсем не растут в адгезированном состоянии.

Имеются такие штаммы животных клеток, которые могут расти и в прикрепленном состоянии, и в виде суспензии. Прикрепивши- еся клетки размножаются, растут и развиваются до тех пор, пока не сольются в монослой, то есть плотность клеток выступает тормозным сигналом. Однако при смене питательной среды на новые порции наблюдается дальнейшее разрастание клеток в форме нескольких слившихся слоев. Подобного результата можно добиться при использовании других факторов воздействия на клеточные культуры (гормоны, ферменты, рН и т. д.). Тем не менее, на практике широко пользуются монослойными культурами.

11.1.1.Глубинное выращивание клеток в монослое. Рост клеток в виде монослоя зависит от адгезивных белков — фибронек- тин о в (от лат. йЬга — нить, пес1еге — связывать или соединять), обеспечивающих межклеточную адгезию, прикрепление клеток к подложке и направляющих их перемещения. В животном организ- ме клетки, способные к перемещениям (особенно в период эмбри- онального развития, при заживлении ран), и связанные с базаль- ными мембранами, содержат на своей поверхности крупномоле- кулярные гликопротеиновые молекулы фибронектина, открытого

535

в 1973 г. Р.О.Хайнсом (Англия), К. Гамбергом и С.-И. Хакомори (США) при изучении нормальных и опухолевых клеток. Фибро- нектин, полимеризуясь, образует длинные нити вокруг клетки, которые контактируют с клеточной мембраной и связываются с цитоскелетным белком-актином (см.). Топология фибронектина в экстрацеллюлярном матриксе схематично представлена на рис.

158.

Молекула фибронектина состоит из двух субъединиц с ММ около 250 кДа, содержащих небольшие по размеру домены и соединенных на одном конце двумя 5—5-мостиками. Размеры одной субъединицы 60—70x2—3 нм; на эту длину приходится от 2145 до 2445 остатков аминокислот. Каждый домен отвечает за одну функцию фибронектина, например, за соединение с фибрином, другой домен — за прикрепление к пластику и т. д. (рис. 152).

Доказано, что фибронектин имеет- ся у всех представи- телей царства АттаНа. Амфотер- ный гликопротеин- фибронектин в изо- лированном виде вы- раженно стимулиру-

ет адгезию, если до- Рис. 152. Схематичное изображение молекулы фиб- бавлять его'К пита-

тельной среде в кон- центрации порядка

1—5 мкг/мл. Амфолит в данном случае выступает мостиком между отрицательно заряженной поверхностью животной клетки и суб- стратом, несущим отрицательный или положительный заряд. Сво- бодная энергия поверхности твердого носителя может быть высо- кой (чистые поверхности стекол, металлов, металлических окислов) или низкой (поверхности из органических полимеров), хотя понят- но, что при соответствующих обработках низкоэнергетические поверхности трансформируются в высокоэнергетические.

В качестве связующих мостиков можно применять ионы каль- ция или магния (рис. 153).

АС

подложка

а

подложка

Рис. 153. Механизм адгезии животной клетки к субстрату (например, к подложке), несущему положительные (а) и отрицательные (б) заряды (А — гликоп- ротеиновый адгезии, стрелки — электростатические взаимодействия, пунктиры — связывание при участии двухвалентных катионов; АС — адсорбционный слой, равный приблизительно 5 нм).

Наряду с плотностью заряда в прикрепляемое™ клеток боль- шое значение имеют характеристики субстрата: гидрофильность его поверхности (смачиваемость), протяженность и горизонталь- ность. Распластываемость клеток на подложке будет выше, если число отрицательных зарядов оказывается не ниже 5 на площади 10 нм². Адгезивные свойства более выражены для смачиваемых поверхностей в сравнении с гидрофобными, по протяженности они должны быть больше нормальной длины клеток; субстраты с искривленной поверхностью хуже гладких — растущие клетки распространяются в направлении наименьшей кривизны субстра- та (здесь существен вклад цитоскелета, см.). Если, например, прикрепление клеток к агар-агару принять за единицу, то к тефлону они прикрепляются в 5 раз лучше, к полиэтилену — в 8 раз, к полипропилену — в 9 раз, к резине — в 12 раз, к алюминию — в 15 раз, к стеклу — в 16 раз, а к стали и полистирену — в 20 раз.

В 1993 г. поступил на рынок пронектин р — продукт белковой инженерии, созданный в Великобритании. Он напоминает ранее названный фибронектин, но пронектин Р включает 13 мест связы- вания на молекулу (в сравнении с нормальным комплементом). Его потенциал к клеточной адгезии в 13 раз выше потенциала фибро- нектина, полученного от млекопитающих. Пронектин Р рекомен- дуют для выращивания клеток в бессыворочных средах.

Крупномасштабное культивирование животных клеток в мо- нослое нацелено на получение наибольшей концентрации клеток в наименьшем объеме газовой фазы.

6

Выбор клеток не столь велик, но некоторые из них вполне адаптированы к условиям выращивания т \а1го. В 1964 г. впервые были получены линии соединительнотканных клеток — фиброб- ластов ВНК 21 от сирийского хомяка. Эти клетки пассируются неограниченно долго и первоначально использовались для репро- дукции вируса ящура для приготовления соответствующих вакцин. Следует иметь в виду, что нормальные диплоидные клетки челове- ка, например, линии \Л/1-38, могут делиться ограниченное число раз (50 ± 10) и проявляют феномен старения (см. раздел З.2.4.). В то же время такие клетки, Как Не1л, выделенные из раковой опухоли шейки матки человека, оказались бессмертными при пассирова- нии.

При доступности донорской ткани используют клетки почек кроликов, обезьян, собак (линия МДСР), 10—14-дневных куриных эмбрионов, клетки из миндалин, амниона, легких эмбриона чело- века 12—16-недельного возраста, клетки эпидермиса взрослого человека, мышиные фибробласты (линия ЬЗ), диплоидные фиброб- ласты человека (линия МКС-5) и другие.

Выбранные клетки выращивают в строго, асептичных условиях в специальном оборудовании (см. главу 7) при медленном вращении роллерной системы или покачивании для омывания большей пло- щади культуральной среды. Клетки то погружаются в жидкую • фазу, то в газообразную. При этом с избытком обеспечиваются их дыхательные потребности в кислороде.

Во время цикла культивирования клеток должны учитываться разные параметры. Одни из них относятся к числу константных, другие — к числу вариабельных. Константными являются качество материала, форма и объем культиватора, вариабельными — ско- рость вращения или покачивания, качество и объем среды, тип клеток и размер (величина) посевного материала, рН и температура среды, снабжение кислородом и содержание С0₂ в культиваторе, окислительно-восстановительный потенциал и концентрация ос- новных источников питания. Первые три вариабельных показателя можно поддерживать постоянными, переводя их в разряд констан- тных.

Естественно ожидать, что среды для клеток животных должны отличаться от сред, используемых, например, для прокариот. На начальных этапах развития зообиотехнологии обязательным было добавление сывороток к средам, применяемым в лабораторных и производственных условиях. Сыворотки обеспечивали клетки не- обходимыми гормонами (глюкокортикоиды, инсулин, половые гор-

538

моны, простагландины и др.)| ростовыми факторами (эпйдермаль- ным, фибробластным, Т-клеточным, тромбоцитарным, опухоленек- ротическим и др.), факторами адгезии (коллаген, фибронектин, ламинин²), белками (альбумин, трансферрин, фетуин³), микроэле- ментами и липидами, для выживания т лагго. Обычно используют фетальную бычью сыворотку (ФБС). Высоким качеством отлича- ются сыворотки, рекомендуемые фирмой 51дта (США). Некоторые из них по качеству (для отдельных линий клеток) превосходят ФБС, например, сыворотка крови новорожденных телят в возрасте до 10 дней и менее, сыворотка от телят возраста менее 10-месячного, лошадиная сыворотка от жеребцов, кастрированных за год до взятия крови.

Вместо натуральных сывороток фирма 1ВР Ъю1еспшс8 (Герма- ния) предлагает высококачественные заменители, в частности, иихозег С — для иммобилизованных клеток. Эта среда содержит мало белка, благодаря чему упрощается очистка биопродукта и достигается стабильность компонентного состава.

Оптимальные показатели рН и температуры зависят от проис- хождения и качества клеточных линий. Так, для клеток млекопи- тающих концентрацию водородных ионов поддерживают в преде- лах рН от 7,2 до 7,4, а температуру — в пределах + 36-^- + 37,5⁴С. Поддержание рН осуществляют обычно за счет буферных систем [(С0₂—КаНС0₃), трис- и др.}, а температуру — с помощью термо- регуляторов.

Контроль за развитием клеток проводят с помощью прямых (подсчет) и непрямых методов (по мутности, по подсчету ядер, по определению общего белка).

Посевной материал (инокулят, от лат. шосшайо — прививание) заметно сказывается на скорости роста клеток в монослойной культуре. В случае применения первичных клеток необходимо иметь их в более высокой плотности на 1 см² внутренней (рабочей) поверхности культиватора.

Если же используют клеточные линии (а не первичные клетки), то плотность инокулята может быть несколько меньшей, так как они почти все 100% адгезируются на поверхности культиватора.

Покачивание или вращение омываемых средой клеток несомненно сказывается на их прикреплении.

11.1.2. Глубинное выращивание клеток в суспензионных куль- турах. Площадь выращиваемых клеток можно существенно уве- личить при использовании микроносителей, суспендируемых в питательной среде и на поверхности которых клетки закрепляются, а затем разрастаются в виде монослоя. Такие суспендированные микроносители с клетками моделируют глубинные культуры, на- пример, микроорганизмов. Следовательно, в таких системах со- вмещаются монослойные и суспензионные культуры животных клеток.

В качестве микроносителей применяют положительно заря- женные ДЕАЕ-сефадексы, сефадексы с коллагеновым покрытием, отрицательно заряженный полистирол, полые стеклянные сферы и др. Так, например, отдельные фирмы предл^агают микросферы из пористого шлачного стекла (рис. 154), которые могут быть использованы для иммобилизации клеток млекопитающих. Поры их доступны для пенетрации (от лат. репеггаио — проникновение) клеток внутрь матрикса, облегчая трехмерную колонизацию внут- ренней поверхности носителя, что способствует взаимодействию метаболизирующих соседствующих клеток и поддержанию их возросших жизнеспособности и продуктивности. Пористые сферы пригодны для иммобилизации прилипающих и суспензионных клеток (например, гибридом).

Рекомендуемый размер сферических микроносителей порядка 200± 25 мкм оценивают оптимальным с удельной плотностью г,03. Требуемое количество их примерно равно 10⁴ мл, а для инокуляции необходимо порядка 10⁵ клеток. При увеличении количества мик- роносителя возрастает доза клеток в инокуляте.

Подход к выбору сред и контролируемого параметра культи- вирования остается прежним. Клетки после выращивания отделя- ют от микроносителей центрифугированием (в том числе — в градиенте плотности), фильтрованием, или, чаще, обработкой трип- сином с последующими промыванием и сепарированием.

Суспензионные клетки на микроносителях применяют в целях получения вирусных вакцин (против бешенства, полиомиелита, ящура).

Возможности переноса генетической информации из эукари- отических клеток в прокариотические сняло проблему массового культивирования животных клеток для получения таких продук- тов, как интерферон, гормоны, лимфокины и другие. Здесь успеш- но развивается рДНК-биотехнология.

Клеткам животных в глубинных культурах .почти во всех случаях требуется защитная матрица, функцию которой берут на себя белки сыворотки крови, добавляемой в среду культивирова- ния. Этим еще раз подтверждается более высокая ранимость животных клеток по сравнению с микробными и растительными клетками. Тем не менее, основные подходы к выбору оборудования и к реализации биотехнологических процессов с использованием животных клеток во многом аналогичны с таковыми в микробной биотехнологии. Например, системы культивирования в обоих слу- чаях могут быть хемо- или турбидостатными, циклическими, не- прерывными или полунепрерывными.

В противоположность суспензионным культурам клеток на микроносителях разработаны способы инкапсулирования их в полимерные сферы (полилизиновые, агарозные, из полимерных смол), когда клетки, по-существу, не испытывают того механиче- ского напряжения, которое они должны проявлять в свободном виде. Эти способы оказались выгодными для культивирования гибридом в целях получения моноклональных антител. Диаметр микрокапсул, размер пор в них и их толщина могут быть незави- симо проконтролированы в процессе изготовления и оптимизиро- ваны для конкретного типа гибридом. Например, согласно данным фирмы Оатоп Вю1есп (Германия) гибридомные клетки человека или животных вначале суспендируют в биосовместимом растворе

541

натрия альгината. Образовавшиеся капельки затем пропускают в раствор кальция хлорида, где они становятся желированными микросферами. На поверхности таких сфер затем формируют полилизиновую мембрану. После этого гель разжижают, оставляя гибридомные клетки в нормальном физиологическом состоянии внутри "дырчатых" микросфер. В процессе культивирования таких инкапсулированных гибридом продукция моноклональных анти- тел возрастает в сотни-тысячи раз по сравнению с обычным культивированием гибридомных клеток. После завершения био- синтеза антител микрокапсулы подвергают диализу для удаления примесных веществ, а затем физически их "раскрывают", гибри- домные клетки и фрагменты капсул легко сепарируются от иско- мых моноклональных антител, которые могут быть подвергнуты дальнейшей очистке или использованы по назначению. Схема описанных процедур представлена на рис. 155.

Полилизиновая мембрана >-°>%-< обеспечивает диффузию неболь- ° о ° —■ —— °5 ших молекул питательных ве-

, 234 ществ внутрь микросфер, но не

позволяет выходить иммунным Рис. 155. Получение моноклональ- глобулинам. Кроме физического ных антител с помощью инкапсулиро- удаления полилизиновой мембра- ванных клеток гибридомы (схема): 1 — ны можно воспользоваться фер- клетки-габридомы. 2 — клетки-гибридо- _ментативнЫМ гидролизом, мы в растворе натрия альгината, 3 — _ ,

_ В описанные микросферы

клетки-гибридомы в желированном рас- ^г

творе натрия альгината, покрытые пол- ВОЗМОЖНО инкапсулировать не илизиновой мембраной, 4—клетки-гиб- только клетки, но и ферменты,

ридомы. в "дырчатых" микросферах, 5 ИНДуКТОры КакиХ-ЛИбО процессов, — антитела и клетки-гибридомы после _а также мультисистемы.

разрушения полилизиновой мембраны. _ _ -

³ Таким образом, глубинное вы-

ращивание животных клеток реализуют в трех вариантах:

1. монослой клеток статичен, культуральная среда подвижна,

2. среда культивирования статична, монослой клеток подвижен,

3) клетки (например, на микроносителях, в мйкросферах) и среда культивирования подвижны. Эти варианты выращивания клеток должны приниматься в расчет при выборе или проектиро- вании соответствующего оборудования.

11.1.3. Другие способы выращивания клеток. В настоящее время в опытно-промышленных условиях получают интерферон,

542

выращивая лимфобласты человека в виде отъемно-доливных куль- тур, то есть когда определенная часть клеточной суспензии заме- щается свежей средой, например, иНговег НУ (Германия), а оста- ющаяся часть "старой" культуры выполняет роль инокулята.

Интерфероны можно получать в периодической культуре, ког- да часть ее отбирают через определенные интервалы времени при непрерывной подпитке свежей питательной средой и при посто- янной скорости ее подачи. Тогда объем культуры прогрессивно возрастает, равно как прогрессивно снижаются скорости ее роста и разбавления.

Как бы долго не удавалось поддерживать клетки в циклических культурах с подпиткой, в конечном итоге они погибают и весь цикл приходится начинать сначала.

Неопределенно длительное время можно выращивать клетки млекопитающих в непрерывных хемостатных культурах, когда удается добиваться постоянства концентрации лимитирующего субстрата и плотности клеток (см. главу 7). Теория и практика непрерывного культивирования впервые сформулированы в 1950 г. Ж. Моно, и, независимо от него, А. Новиком и Л. Сцилардом, предложившими термин "хемостат". В хемостатах скорость подачи свежей среды и отбора культуры равны (как и объем их). Скорость роста, развития и размножения клеток контролируется скоростью подвода лимитирующего компонента, а численность — его концен- трацией. В качестве лимитирующего рост агента чаще всего ис- пользуют глюкозу, реже — фосфат и другие вещества. При правильном подборе условий выращивания в хемостатах удается на порядок увеличить выход клеток по сравнению с периодическим культивированием. Причем, хемостатные культуры отличаются накоплением физиологически однотипных клеток. Это можно показать на примере с клетками лейкемии мышей — Ь 1210 (таблица 55), которые засевали (инокулят) в концентрации 2* 10⁵ клеток/мл для периодического культивирования, длившегося 3 суток до получения максимальной плотности 2,5* 10⁶ клеток/мл (суспензионные культуры). При хемостатком культивировании скорость подачи среды и отъема культуры составляла 0,3 сут"'.

Естественно, что время, затрачиваемое на подготовку смежных циклов и их реализацию при периодическом культивировании, является непроизводительным.

11.2. Эмбриональные и другие ткани для репродукции вирусов и получения вирусных вакцин. Из эмбриональных тканей наибо- лее широко используемыми являются эмбриональные ткани цып- ленка, мыши и человека. Особенной выгодой отличаются куриные эмбрионы (по доступности) десяти-двенадцатисуточного возраста, используемые преимущественно для репродукции вирусов и по- следующего изготовления вирусных вакцин. Куриные эмбрионы введены в вирусологическую практику в 1931 г. Г. М. Вудруфом и Е. У. Гудпасчером. Такие эмбрионы рекомендуют также для выяв- ления, идентификации и определения инфицирующей дозы виру- сов, для получения антигенных препаратов, применяемых в серо- логических реакциях.

Инкубированные при 38°С куриные яйца овоскопируют (про- свечивают), отбраковывают, "прозрачные" неоплодотворенные эк- земпляры и сохраняют оплодотворенные, в которых хорошо видны наполненные кровеносные сосуды хорионаллантоисной оболочки и движения эмбрионов.

Заражение эмбрионов можно проводить вручную и автомати- зированно. Последний способ применяют в крупномасштабном производстве, например, противогриппозных вак- цин. Материал, содержащий вирусы, вводят с помощью шприца (батареи шприцов) в различные части эмбриона (эмбрио- нов) (рис. 156).

Все этапы работы с куриными эмбрионами после овоскопии проводят в асептичных условиях (см. главу 6). Материалом для за- ражения могут быть суспензия растертой мозговой ткани (при- менительно к вирусу бешенства), печени, селезенки, почек (приме- нительно к хлам и дням орнитоза) и т. д. В целях деконтаминации вирусного материала от бактерий или в целях предотвращения его бактериального загрязнения можно использовать соответству- она, 5-оболочкаамниона,б-желточный _ющие антибиотики, например,

мешок, 7 - белочный мешок, 8 - воздуш- „ _с

ное пространство, 9 - скорлупа, 10 скорлупная оболочка, 11 - введение ви русного материала в аллантоисную по лость.

¹ _{пенициллин с каким-либо ами- ногликозидом порядка 150 МЕ каждого на 1 мл суспензии виру- сосодержащего материала. Для борьбы с грибковым заражением эмбрионов целесообразно воспользоваться некоторыми антибио- тиками-полиенами (нистатин, амфотерицин В) или отдельными производными бензимидазола (например дактарин и др.).}

Чаще всего суспензию вирусного материала вводят в алланто- исную полость или, реже, на хорионаллантоисную оболочку в количестве 0,05-0,1 мл, прокалывая продезинфицированную скор- лупу (например, иодированным этанолом) на расчетную глубину. После этого отверстие закрывают расплавленным парафином и эмбрионы помещают в термостат, в котором поддерживается оптимальная температура для репродукции вируса, например 36- 37,5°С. Продолжительность инкубации зависит от типа и активно- сти вируса. Обычно через 2-4 суток можно наблюдать изменение оболочек с последующей гибелью эмбрионов. Зараженные эмбри- оны контролируют ежедневно 1-2 раза (овоскопируют, поворачи- вают другой стороной). Погибшие эмбрионы затем передают в отделение сбора вирусного материала. Там их дезинфицируют, аллантоисную жидкость с вирусом отсасывают и переносят в стерильные емкости. Инактивацию вирусов при определенной температуре проводят обычно с помощью формалина, фенола или других веществ. Применяя высокоскоростное центрифугирование

или афинную хроматографию (см.), удается получать высокоочи- щенные вирусные частицы.

Собранный вирусный материал, прошедший соответствующий контроль, подвергают лйофильной сушке. Контролю подлежат следующие показатели: стерильность, безвредность и специфиче- ская активность. Применительно к стерильности имеют в виду отсутствие: живого гомологичного вируса в убитой вакцине, бак- терий и грибов. Безвредность и специфическую активность оце- нивают на животных и только после этого вакцину разрешают испытывать на волонтерах или добровольцах; после успешного проведения клинической апробации вакцину разрешают приме- нять в широкой медицинской практике.

На куриных эмбрионах получают, например, живую противо- гриппозную вакцину. Она предназначается для интраназального введения (лицам старше 16 лет и детям от 3 до 15 лет). Вакцина представляет собой высушенную аллантоисную жидкость, взятую от зараженных вирусом куриных эмбрионов. Тип вируса подби- рают согласно эпидемиологической ситуации и прогнозам. Поэто- му препараты могут выпускаться в виде моновакцины или дивак- цины (напрмер, включающая вирусы А2 и В) в ампулах с 20 й 8 прививочными дозами для соответствующих групп населения. Высушенная масса в ампулах обычно имеет светло-желтый цвет, который сохраняется и после растворения содержимого ампулы в прокипяченой остуженной воде.

Живые противогриппозные вакцины для взрослых и детей готовят и для приема через рот. Такие вакцины представляют собой специальные вакцинные штаммы, репродукция которых происхо- дила в течение 5-15 пассажей (не менее и не более) на культуре почечной ткани куриных эмбрионов. Их выпускают в сухом виде во флаконах. При растворении в воде цвет из светло-желтого переходит в красноватый.

Из других вирусных вакцин, получаемых на куриных эмбрио- нах, можно назвать противопаротитную, против желтой лихорад- ки.

Из прочих эмбриональных тканей используют эмбрионы мы- шей или других млекопитающих животных, а также абортирован- ные плоды человека.

Эмбриональные перевиваемые ткани доступны после обработ- ки трипсином, поскольку в таких тканях еще не формируется большого количества межклеточных веществ (в том числе небел-

546

ковой природы). Клетки разделяются и после необходимых обра- боток их культивируют в специальных средах в монослое или в суспендированном состоянии.

Ткани, изолируемые от животных после рождения, относятся к разряду зрелых. Чем их возраст больше, тем с большим трудом они культивируются. Однако после успешного выращивания они затем "выравниваются" и мало чем отличаются от эмбриональных клеток.

В целях репродукции вирусов особую роль сыграли почечные и амниотические зрелые ткани. Из них первые получали от обезъ- ян, вторые — из амниотических оболочек от женщин-рожениц при нормальных родах. Свежие почки от здоровых обезьян, например макаки резус или африканских зеленых мартышек (сразу же после экстирпации, от лат. ехиграИо — полное вырезание, вылущение, искоренение) декапсулируют, рассекают пополам, удаляют лохан- ки, нарезают паренхиматозную ткань на мелкие кусочки, трипси- низируют и клетки (порядка 3 • 10³/мл) помещают в специальную среду, термостатируют при 45°С в качающихся аппаратах. Спустя сутки, культуру заражают, например, вирусом полиомиелита и уже через 4-7 дней в надосадочной жидкости накапливается вирус. Эту жидкость сливают, к ней добавляют формалин до получения 0,025%-й концентрации и смесь оставляют при 37°С на 12 дней для полного обезвреживания вируса. После этого препарат подвергают диализу с последующим контролем на отсутствие живых вирусных частиц, токсичности, безвредности и на активность. Таков принцип изготовления полиовакцины Дж. Солка. В случае приготовления живых вакцин из ослабленных (аттенуированных) штаммов виру- сов исключают- стадию обработки формалином. Так получают, например, живую полиовакцину А. Себина (иммунологических типов I, II, III). В целях термостабилизации вакцины к ней добавляют химически чистый магния хлорид. Вакцину выпускают в жидком виде (по 5 мл) и в форме конфет-драже. Жидкая форма имеет красновато-оранжевый цвет; цвет драже различен: розовый — для первого иммунологического типа вируса, сиреневый—для второго типа, голубой — для третьего, типа и белый — для смеси всех трех типов.

Кроме полиомиелита специфическую профилактику живыми вакцинами проводят при кори. Противокоревую живую сухую вакцину изготавливают из вакцинного штамма, репродукция ко- торого осуществлялась на клеточных культурах почек морских свинок или фибробластах японских перепелок. Сухая вакцина

547

имеет желтовато-розовый цвет, который может сохраняться после растворения ее в прилагаемом к упаковке растворителе. Выпуска- ют во флаконах по 1,2,5 и 10 прививочных доз. После растворения вакцину вводят в количестве 0,5 мл подкожно или по 0,1 мл внутрикожно. Она предназначается для не болевших корью детей в возрасте от 10 месяцев до 8 лет (по показаниям — до 14 лет).

Вакцина против клещевого энцефалита является формолвак- циной, полученной из тканевой культуры фибробластов куриного эмбриона и выпускаемом в жидком виде во-флаконах (по 10 мл) или ампулах (по 5 мл) с гидроокисью алюминия (до 2 мг) в качестве адсорбента или в лиофильно высушенном виде с желатином (до 1|5%).и сахарозой (до 8%). Вакцину вводят подкожно (жидкую или после разведения в дистиллированной воде сухого препарата).

По способам культивирования особое место занимает вирус бешенства. Его репродукцию осуществляют на мозговой ткани целостных организмов, используя для этого кроликов, крыс, овец. Л. Пастер в 80-е годы XIX века выделил от больной собаки вирус бешенства, и после ряда его пассажей через мозг кроликов он добился того, что вирус приобрел свойства вызывать заболевание у данных животных после определенного и постоянного инкуба- ционного периода (4-6 дней). Такой вирус, в отличие от вируса "уличного" бешенства, получил название Уагив йхе (фиксирован- ный вирус). Его-то и применяют для получения вакцин.

В целях профилактики бешенства используют сухие антира- бические вакцины Ферми и МИВП. Первую из них готовят из мозга овец возраста до 1 года, вторую — из мозга сосунков белых крыс (возраст 4-8 суток) после заражения тех и других фиксиро- ванным вирусом бешенства. Подобные вакцины представляют собой суспензии мозговых тканей, содержащих указанный вирус. В сухом виде вакцины выпускают в форме таблеток беловато-се- рого цвета, которые суспендируют в прилагаемом растворителе (дистиллированная вода) и сразу же вводят подкожно. Хранение разведенных вакцин впрок запрещается.

Вакцина против краснухи содержит живой ослабленный (ат- тенуированный, от лат. аИепиаге — уменьшать) вирус, репродуци- ровавшийся на диплоидных клетках человека или на клетках почек кролика. Используют для профилактики краснухи.

Клетки амниона человека должны быть получены не позднее 12 часов после родов. Для этого послед помещают в стерильный контейнер без применения антисептиков и в ближайшие после этого часы отделяют амнион от хориона, промывают специальным

548

солевым раствором и дважды последовательно трипсинизируют. После этого клетки центрифугируют — примерно при 100д в течение 10 минут, ресуспендируют осадок в среде и подсчитывают образовавшиеся изолированные клетки (необходимо получить по- рядка 106 клеток в 1 мл). Их суспендируют и переносят в большие емкости до получения 10⁶ клеток в 1 мл питательной среды, сменяя ее каждые 5-7 дней. Полученные клетки можно использовать для культивирования вирусов.

Перевиваемые опухоли животных, в частности, асцитные, нашли широкое применение на практике. Они хорошо растут в форме суспензии изолированных клеток в экссудате брюшной полости, например, мышей и крыс. Опухолевые клетки размножа- ются в асцитической жидкости, которую отсасывают из брюшной полости с помощью шприца (или с помощью пипетки после оперативного вмешательства). Такие клетки можно также выра- щивать т \чгго.

Перевиваемые опухоли животных представляют определенную ценность при изучении противоопухолевых химиотерапевтиче- ских веществ. Для выращивания опухолевых клеток могут оказать- ся полезными так называемые кокарциногены — вещества, индут цирующие формирование опухолевой ткани, хотя сами не явля- ются карциногенами. Среди известных кокарциногенов наиболее сильным триггерным действием (от англ. 1пддег — спусковой крючок, "собачка") обладает тиглиан — природный вторичный метаболит у растений, относящихся к семействам ЕирЬогЫасеае (молочайные) и Тпуте1аеасеае (тимиановые). Он является природ- ным ажгооболом из гтгппът тетрациклических дитерпенов с пер- ом он гидро-циклопропа-бензазуленовым скелетом. В этом скелете содержится 7 хиральных атомов углерода, и, сле- довательно, возможно существование большого числа изомеров. Из всех фороболов только производные 4р*- форобола являются активными, но не производные 4а стереоизомеров. 4р-форобол Предполагают, что их деградация про-

исходит замедленно и поэтому они могут непрерывно активировать фермент протеинкиназу С. Это, в свою очередь, стимулирует специфические протеазы, катализи- рующие реакцию распада фермента с последующим серьезным нарушением клеточной регуляции, сопровождающейся индукцией

549

опухолевого роста.

Необходимо также помнить, что фороболы еще стимулируют клеточную пролиферацию, митогенез лимфоцитов, продукцию простагландинов, дегрануляцию нейтрофилов, синтез ДНК, изме- нения в свойствах мембран и др. Однако в связи с высокой биологической активностью, эфиры форобола представляют опре- деленную опасность для здоровья работающих с ними лиц. Поэтому операторы должны надевать перчатки, защитные очки и прочую одежду, чтобы защитить кожу и глаза от контакта с этими веще- ствами.

Для инактивации эфиров форобола их необходимо растворить в органическом растворителе, смешивающимся с водой, в равном объеме 10% водного раствора натрия гидроксида. Гидролиз эфиров завершается в срок до одного часа выдержки, после чего щелочной раствор становится безопасным.

Водные растворы эфиров форбола могут быть обезврежены добавлением около 10 % по объему натрия гипохлорита.

Способствует росту опухолевых клеток (-)-индолактам, являю- щийся производным индола. Его эффективность в других биоло- гических системах различна*, что может быть объяснено различным аффинитетом к С-подтипам протеинкиназы; стереоизомер (+)-ин- долактам не обладает стимулирующим действием, но его можно использовать в качестве субстанции для негативного контроля.

В таком же плане могут быть использованы новые, человече- ского происхождения, гормоноподобные ростовые факторы: инсу- лино-подобные (1СР 1 и 2), тромбоцитарные (РОСР, от англ. Р1а1е1е1 Оепуег1-Сголу1Ь-Рас1ог8), трансформирующие ростовые (ТСРаи Р), некроза опухолей (ТЫРсл).

1СР 1 — полипептид, состоящий из 70 аминокислотных остат- ков, спирально закрученный и удерживаемый в таком состоянии благодаря трем 5-5 — мостикам между остатками цистеина (рис. 157). Первый из них соединяет дисульфидной связью 6-й и 48-й остатки, второй — 18-й и 61-й остатки, третий—47-й и 52-й остатки. 1СР 1 является пептидным гормоном, влияющим на рост и обмен веществ организма после рождения. Его секреция находится под влиянием уровня гормонов роста в сыворотке крови и характера питания ребенка.. 1СР 1 влияет на рост и дифференциацию многих типов животных клеток, включая мышиные клетки — предшест- венники эритроцитов последней стадии и эпителиальные клетки млекопитающих, крысиные миобласты, олигодендроциты, клетки черепа и клетки зобной железы; человеческие хондроциты и

550

адренергические нейробластные клетки.

Вариантом ЮР 1 является укорочен- ный на Ы-терминальный трипептид-моз- говой ЮР, изолированный из мозга плода и взрослого человека. Этот пептидный гормон важен для роста и метаболизма центральной нервной системы. Он в 4 раза сильнее 1СР 1 по стимуляции синте- РисЛ57.Полипеотид1СР- ^за А^{нк в} фетальных мозговых клетках 1 (схема). крыс и более выраженно реагирует в

перекрестных реакциях с рецепторами для ЮР 1 на мембранах мозга у плода и взрослого человека.

ЮР 2 — полипептид, состоящий из 67 аминокислот (ММ-7470). Как и ЮР 1 является сильным митогеном для многих клеток. Как полагают, он — важный регулятор роста соматических клеток, стимулирующий их размножение.

Тромбоцитарный ростовый фактор РБСР — гомодимерный, мультифункциональный полипептид, который действует как силь- ный митоген в отношении широкого набора эндотелиальных кле- ток фибробластов. Его рассматрвают как вещество, играющее важную роль в восстановлении тканей и воспалении. РБСР — хемоаттрактант для фибробластов, гладкомышечных клеток, моно- цитов и нейтрофилов, что играет немаловажную роль в заживлении ран.

В отвечающих на РБСР клетках индуцируются оборот фосфа- тидилинозита, метаболизм простагландинов и активируются фос- фолипазы. В человеческих фибробластах кожи, стимулированных РБСР, возрастает в три раза коллагеназная активность. Полагают, что он принимает участие в трансформации клеток и вовлекается в процесс атеросклероза.

Следует отличать РБСР от фактора активации тромбоцитов (РАР, от англ. р1а1е1е1 асиуатдпд 1"ас1ог) — это фосфолипид, образу- емый тромбоцитами, макрофагами, нейтрофилами и эозинофила- ми под влиянием воспалительного стимула.

Он синтезируется из клеточ- р ных мембран под влиянием фос-

/Ч₀ г— о— (сн₂»ц,— сн₃ фолипазы А 2 вначале в форме

сн₃ V/ ¹¹ _сн предшественника — 1уво-РАР,

н^^~⁰^ _п——»_м+^сн³₃ который затем превращается в

РАР под влиянием ацетил-транс- фер азы (этот же энзим катали- кар; п может бы» 15 или 17 зирует реакцию обратной транс-

формации РАР в 1уво-РАР).

РАР — исключительно потентная субстанция. Она индуцирует агрегацию тромбоцитов, будучи в фемтомолярных концентрациях (10¹⁵). После парентерального введения или вдыхания РАР вызы- вает бронхоспазм и повышенную проницаемость микрокапилля- ров; количество кровяных пластинок и нейтрофилов в крови падает при одновременном клеточном скоплении в легких. Введенный внутрикожно он вызывает формирование пустулы и повышение температуры при устойчивой клеточной инфильтрации. РАР обла- дает сильным хемотаксическим эффектом, вызывая накопление нейтрофилов и эозинофилов, активирует их в плане образования других воспалительных компонентов (супероксидных анионов 0\ и эйкозаноидов).

СгоН^соон; сн^-(сн₂)_А- СН -СН-СН₂- СН= СН - СН₂- СН=СН-СН₂

эйкозанкарбоновая НООС - (СН,),- СН=СН

кислота _ _ _ ,, , .

эикозантетраен-5,8,11,14-овая кислота

(арахидоновая кислота)

Ингалированный РАР повышает экскрецию лейкотриёнов с мочой, возможно потому, что он стимулирует повышенное накоп- ление их в легких как медиаторов воспаления. Лейкотриены ранее называли "медленно реагирующими субстанциями" при анафилак- сии (5Р5-А).

лайнярши 0₄ мйплрмн Е₄

ТОР — гормоноподобные вещества, которые могут индуциро- вать временный неопластический рост и дифференциацию нор- мальных клеток. Фибробласты в среде с ТСР не нуждаются затем в субстрате для роста и не отвечают на межклеточные контакты. После удаления ТСР из культуральной среды клетки возвращаются к нормальному росту.

ТСРа близко родственен эпидермальному ростовому фактору (ЕСР) благодаря обладанию тем же клеточным рецептором.

552

ТСРос — одиночный полипептид, содержащий 50 аминокислотных остатков; он взаимодействует с тем же рецептором, что и ЕСР и проявляет такую же потенцию в индуцировании тирозин-киназной активности, связанной с ЕСР-рецептором. ТСРа, в отличие от ЕСР, "запускает" эмбриогенез и активацию протоонкогенеза в течение регенерации поврежденных тканей.

ТСРр — кислотостойкий полипептид, состоящий из двух иден- тичных субъединиц со 112 аминокислотами в каждой. Его ММ-25 кДа; изолированы ТСРР — 1 и 2 с 71% гомологией между ними и сходной функциональной активностью. В частности, ТОрр играет важную роль в генезе опухолей, развитии эмбриона, тканевой репарации и иммунорегуляции. ТСРР — ингибитор роста для большинства типов клеток, но может стимулировать образование внеклеточных матриксных белков типа фибронектина и коллагена. ТСРа и Р выступают синергистами при трансформации различных клеточных линий.

В регуляции поведения клеток важную роль отводят семейству из четырех синдеканов, являющихся поверхностными протеогли- канами клеток. Из них более детально изучен синдекан - 1.В его так называемом внешнем домене, или эктодомене содержатся ковалентно связанные цепи гликозаминогликанов, состоящие пре- имущественно из гепарансульфата, а также из хондроитинсульфа- та. Синдекан - 1 селективно связывает различные внеклеточные матриксные молекулы через его гепарансульфатные цепи. Одно- временно он может связывать ростовые факторы и выступать вектором сайта стимуляции роста; здесь (в месте взаимодействия синдекана-1 с матриксом) иммобилизуется рецепторный комплекс для тирозинкиназы (рис. 158).

Плазматические клетки и ряд человеческих В-клеточных опу- холевых линий экспрессируют синдекан-1 преимущественно в видегепарансульфат-протеогликана. Способность В-клеточных ли- ний связывать фибронектин и фибриллярные коллагеновые мат- рицы четко коррелирует с их экспрессией синдекана-1 на клеточ- ной поверхности. Экспрессия этого протеогликана также сопря- жена с пролиферацией клеток и, как предполагают, с малигниза- цией их (от лат. талдпив — злокачественный).

Кроме стимуляции роста синдекан-1 также участвует в регуля- ции морфологии клетки благодаря содействию организации эле- ментов цитоскелета, прежде всего, эпителиальных клеток.

Менее изученными гепарансульфат-протеогликанами являют- ся синдекан-2 (фиброгликан), синдекан-3 (Ы-синдекан) и синдекан- 4 (риудокан, амфигликан). Последнему приписывают внутрикле- точную функцию возможного связывания других мембранных белков или цитоскелета.

Более "многоликим" представляется ТЫРа — полипептид с ММ 17 кДа. Он — медиатор воспаления и играет выдающуюся роль в патогенезе эндотоксического шока, вызванного грамотрицатель- ными бактериями. ТЫРа стимулирует активность коллагеназы и продукцию простагландина Е₂ синовиальными клетками, актив- ность остеокластов и резорбцию костной ткани, способствует ангиогенезу, стимулирует пролиферацию фибробластов, индуци- рует высвобождение ИЛ 1 и 6, РБСР. Вместе с тем, он — цитоток- сический и цитостатический ингибитор опухолевого роста, вовле- кается в патологические процессы типа раковой кахексии, или истощения (от греч. каков — плохо, оех1в — состояние) и цереб- ральной малярии (от лат. сегеЪгит — головной мозг). Установлено, что убитые клетки 51арпу1ососсив аигеив стимулируют продукцию ТЫРа в культурах мононуклеарных фагоцитов или моноцитов крови человека. Предварительная обработка клеток бисбензили- зохинолиновым алкалоидом тетрандрином подавляет эту продук- цию. Поэтому высказано предположение о том, что тетрандрин можно использовать для лечения воспал ительных заболеваний, при которых Т№а играет основную роль.

С добавлением или без добавления фороболов и ростовых факторов клетки опухолей теряют присущий нормальным клеткам фибронектин, округляются и в таком виде продолжают размно- жаться и существовать в ряду поколений. Привнесение к ним извне фибронектина сопровождается восстановлением их способности

554

к адгезии, но без реверсии в нормальные клетки по физиолого-би- охимической сущности, то есть они все равно остаются опухоле- выми.

Следует отметить, что в культуру давно введены клетки крови, соединительной ткани и другие (см., например, раздел 11.4). Сое- динительнотканные клетки — фибробласты (от лат. йЪга — нить, волокно; от греч. Ыав1о8 — почка, росток, отпрыск) характеризу- ются выраженной адгезивностью благодаря обильной продукции ими фибронектина (см. рис. 152), поэтому их монослойные куль- туры всегда удаются с определенным успехом.

В искусственных условиях удается культивировать клетки эпи- дермиса кожи, то есть диплоидные и "продвинутые" в дифферен- циации клетки. Направленность такой работы, главным образом, практическая и результаты ее бесценны для ожоговых клиник. По сообщению немецких ученых (1988) за 6—7 недель из кусочка кожи размером 2 см² можно получить "кожу" размером 1—2 м². Для этого у пациента, которому предстоит пересадка кожи, берут кожный лоскут и помещают в раствор специальных ферментов, эпидермис отделяется от подлежащих слоев кожи, его промывают и переносят в питательную жидкость. Клетки делятся, а в присут- ствии стимуляторов их рост еще более ускоряется.

11.3. Получение инсектопатогенных вирусов в клеточных культурах. Культуры клеток и тканей насекомых приобрели боль- шое значение в различных биологических науках (эндокринология, биохимия, вирусология и др.) ив биотехнологии. Это стало воз- можным благодаря разработкам соответствующих сред, на кото- рых хорошо развиваются указанные биообъекты, а на объектах, в свою очередь, можно с успехом поддерживать рост соответствую- щих патогенов, поражающих растения, животных и человека (членIгстоногие паразиты и вирусы). Более того, на культурах клеток и тканей насекомых можно обеспечить продукцию виру- лентных инсектовирусов и рекомбинантных белков, используя вирусы насекомых в качестве векторов. В этой связи велика роль таких культур в контроле за чумой, используя биотехнологию.

Прогресс в получении клеточных линий насекомых был после- довательно обеспечен трудами В. Трагера в конце 30-х годов текущего столетия, С. Вьятта (1956), Т. Д. С. Грейса (1962). Грейс модифицировал среду Вьятта, включавшую 21 аминокислоту, пять солей, три сахара, три органические кислоты (рН=6,3—6,5), доба- вив в нее 9 витаминов комплекса В. В результате ему удалось изолировать 4 культуры, ставшие стабильными линиями клеток

555

насекомых. В последующие годы были получены самые различные клеточные линии от насекомых, относящихся к различным поряд- кам, но с преобладанием 01р1ега (мухи, комарщ) и ЬерШор1ега — бабочки (от греч. сЩв) — два, дважды, двух; р1егоп — крылышко; 1ер18 — чешуя). Для них наиболее часто используют среды Дж. Митсухаси и К. Марамороша (среда ММ), Шилда и Санга (среда МЗ), Шнейдера; Эхальера и Оганесяна (среда 0-22), 1РЬ-41 и другие. Фирма 51дгпа (США) выпускает указанные среды в сухом виде.

Технология выращивания вирусов на культурах клеток насе- комых принципиально'мало чем отличается от выращивания дру- гих вирусов на клетках животных и человека (см. раздел 11.1).

11.4. Интерфероны. Интерферон открыт А; Айзексом и Дж. Линдеманом в 1957 г. в клетках цыпленка, зараженных вирусом гриппа. Это видоспецифическое белковое вещество, синтезируе- мое лейкоцитами в ответ на воздействие интерфероногенов. При- менительно к млекопитающим и, прежде всего, человеку под названием "лейкоциты" объединяют все белые клетки крови (от греч. 1епсов —. белый, ку1ов —¹ ячейка, клетка) — сегментоядерные лейкоциты (нейтрофильные, эозинофильные, базофильные), или микрофаги, лимфоциты (Т и В) и моноциты. Все эти клетки являются ядерными и участвуют в обеспечении постоянства внут- ренней среды макроорганизма (гомеостаза), включая неспецифи- ческую и специфическую защиту, или иммунитет. Однако сегмен- тоядерные лейкоциты относят к разряду полинуклеарных, тогда как моноциты — к разряду мононуклеарных. Мононуклеарными фагоцитами (наравне с моноцитами) являются также гистиоциты, или'макрофаги. К ним относят макрофаги соединительной ткани, звездчатые клетки Купфера в печени, альвеолярные макрофаги в легких,-свободные-й фиксированные "макрофаги в лимфоузлах й селезенке, гистиоциты в коже, остеокласты в костной ткани, фиксированные макрофаги в костном мозге, макрофаги в серо- зных полостях (плевральной и брюшной); макрофаги в нервной ткани (клетки микроглии).

С учетом топологии и/или функции макрофаги подразделяют еще на резидентные, эксудативные (макрофаги воспалительного эксудата), активированные, индуцированные.

Моноциты, макрофаги и их предшественники объединены в так называемую систему мононуклеарных фагоцитов (СМФ). Ге- неалогия (от греч. депеа — рождение, происхождение, 1одов — обсуждение) клеток крови изучена достаточно глубоко.

Лейкоциты и другие клетки млекопитающих, в частности, при

556

заражении вирусами продуцируют не один интерферон, а больше, объединяемых в семейство интерферонов, ингибирующих продук- тивный цикл репликации вирусов. Вот почему они являются оружием первой линии защиты против вирусных инфекций.

Однако в обычных (неиндуцированных) клетках интерфероны не выявляются. Некоторые характеристики отдельных интерфе- ронов приведены в таблице 56.

Таблица 56 Некоторые характеристики интерферонов человека

Тип интер- ферона	Характеристики
	клетки - проду- центы	индук- тор	ЧИСТКУ генов интер- фе, рона	локали- зация в хро- мое о- мвх	нали- чие нитро- нов в генах	стабиль- ность при рНз	-актив- ность в присут- ствии ДОС	длина сигналь- ной после- дова- тельно- етти (ч.амк-т)	ч. амк-т		ММ. кДа
									в пер- вичной моле- куле	в окон- чатель- ной моле- куле
а	лейко- циты пери- фери- ческой крови	вирус-, ная индук- ция, двух- нитевая РНК	14	*9		па	* -да	23	166	143	17
Р	фиб- робпо- сты	—"—	2 159))	9.2,5	—	да	да	21	166	145	17
У	лимфо- циты	«итоге- ны (для несен- снбили- зироеан- НЫХ ГШМг-' фоци- . тов), ;Ст*вци- фичес. АГ (сенси- билизи- рован- ные лим- фоциты}	1	12	+	нет	нет	20	166	146	17

Примечание: ДДС — натрия додецилсульфат; ч. амк-т — число аминокислот, ММ — молекулярная масса в килодальтонах; АГ — антигены.

Как следует из таблицы размеры молекул интерферонов близки по числу аминокислот и молекулярной массе, хотя по другим признакам они различны; интерфероны Р и у являются гликопро- теинами, тогда как интерферон а — протеином.

557

Интерфероны — клеточные белки и поэтому они видоспеци- фичны, то есть каждому виду животного свойственен свой интер- ферон, но не являются вирусоспецифическими. При смешанной вирусной инфекции один вирус подавляет другой за счет интер- фероногенности первого — феномен вирусной интефе- р е н ц и и. Иногда эта видоспецифичность очень узкая, например, для курицы, утки, мыщи и крысы, но не перекрестно в группах птиц и грызунов или между группами. Однако есть исключения — человеческий интерферон защищает клетки крупного рогатого скота лучше, чем коровий интерферон.

Человеческие интерфероны а и Р продуцируются преимуще- ственно лейкоцитами, В-лимфобластами и соединительнотканны- ми клетками мезенхимного происхождения — фибробластами в ответ на вцрусную инфекцию. Интерферон у прежде называли иммунным, или тип 2; он образуется несенсибилизированными лимфоидными клетками Т-лимфобластами в ответ на митогены, и сенсибилизированными лимфоцитами при стимуляции специфи- ческими антигенами (таблица 57). Таблица 57. Виды индуцируемых интерферонов

Интерфероны	Система
	индуктор	клетки-продуценты
лейкоцитарный-а	вирус	лейкоциты периферической крови
лимфобластный-а		В-лимфобласты
фибробластный-Р		фибробласты
имунный-у	митоген	лейкоциты периферической крови или Т-лимфобласты
	специфический антиген	лимфоциты

Установлено, что индукторами интерферонов могут быть: инак- тивированные температурой или УФЛ вирусы гриппа, рео-, рота- и другие вирусы; двухнитевые РНК (например, реовирусная); некоторые полианионные вещества (бактериальные эндотоксины, поликарбоновые кислоты, сополимеры пирана); синтетические двухнитевые полирибонуклеотиды, например, полиИ: полиЦ —

558

можно достичь супериндукции интерферона, если обрабатывать клетки полиИ: полиЦ вместе с циклогексимидом (ингибитором синтеза белка), а спустя 5 часов — актиномицином Д. Механизмы индукции интерферона до конца еще не изучены и трудно объяс- нить почему, например, двухнитевые РНК стимулируют образова- ние интерферона, а двухнитевая ДНК не обладает аналогичным действием.

На практике интерферон-а выделяют из лейкоцитов при низ- коскоростном центрифугировании свежевыделенной крови чело- века. Лейкоциты переносят в культуральную среду, содержащую либо сыворотку крови человека или казеин молока, в среду вносят вирус — интерфероноген (вирус Сендай или вирус ньюкаслской болезни), выдерживают в течение ночи, после чего лейкоциты отделяют центрифугированием, вирус — интерфероноген инакти- вируют любым из приемлемых способов. Супернатант (от лат. 8ирета1ап8 — плавающий на поверхности), или надосадок пред- ставляет собой нативный интерферон. Его лиофильно высушивают и выпускают в ампулах. Это — пористый, серовато-коричневый порошок, легко растворимый в воде. Растворенный препарат имеет розовато-красноватый цвет и слегка опалесцирует. Из нативного интерферона можно получить концентрированный интерферон путем очистки колоночной хроматографией на сефадексах. Пол- ученный препарат после высушивания имеет вид пористого по- рошка серовато-белого цвета, хорошо растворимый в воде. Тот и другой интерфероны должны быть стерильными.

Активность препаратов определяют титрованием на первичных культурах клеток, например, кожно-мышечной ткани эмбриона человека с вирусом везикулярного стоматита. Противовирусная активность (так называемая удельная активность) нативного ин- терферона должна быть не менее 32 единиц, концентрированного — 100 единиц. Для очистки интерферона можно прибегнуть и к высоко эффективной жидкостной хроматографии.

Интерферон Р получают из фибробластов, выращенных в монослойной культуре, индуцированной полиИ: полиЦ в присут- ствии циклогексимида и актиномицина Д. Обычно интерфероны продуцируются в малых количествах (около 1 мг на 10 л тканевой культуральной жидкости) и, к тому же, после 48—72 часов клет- ки-продуценты отмирают. Вот почему производство лейкоцитар- ных интерферонов относят к разряду дорогостоящих и экономи- чески— мало выгодных. Поэтому успешно завершившиеся работы

559

по генно-инженерному интерферону помогли решить и эти про- блемы.

В начале 80-х годов XX в. британская фирма Тле \Л/е11соте Роипйагюп 1ЛЮ передала на клинические испытания природную смесь а-интерферонов, полученную в глубинной суспензионной культуре вирусоиндуцированных человеческих лимфобластов. Препарат был назван "велфероном". Выпускается в виде стериль- ной, прозрачной, бесцветной жидкости по 1 мл (3 мегаединицы- МЕ). К 1988 году уже три фирмы выпускали а-интерфероны:

1. выше названный велферон — фирма \Л/е11соте Роипй.,

2. интрон А — фирма ЮгЪу-\Л/агпск,

3. роферон А — фирма КосЬе.

Интрон А и роферон А являются генно-инженерными препа- ратами, содержащими лишь один субтип а-интерферона и разли- чающиеся по одной аминокислоте. Так, роферон А обозначается как интерферон ос2а; он содержит в полипептидной цепи лизин в позиции 23. Интрон А - это ос2Ъ-интерферон, содержащий аргинин вместо лизина. Как оказалось, роферон А индуцирует антителооб- разование примерно у 25% больных, у которых благодаря этому нейтрализуется введенный интерферон. Технологическая схема получения генно-инженерных интерферонов (как одна из возмож- ных) принципиально сводится к следующему:

1. индукция синтеза и выделение интерфероновой мРНК из клеток,

2. получение кДНК, комплементарной интерфероновой мРНК из лейкоцитов,

3. встраивание кДНК в плазмиду,

4. введение реконструированной плазмиды в клетки Е. соИ,

5. размножение бактерий, содержащих реконструированную плазмиду, в культуральной среде,

6. сепарирование клеток Е. соЦ,

7. дезинтеграция и экстракция клеток Е. соП,

8. осаждение (например, полиэтиленамином) с последующим центрифугированием,

9. высаливание интерферона из супернатанта аммония сульфа- том,

10. диализ осадка интерферона,

11. растворение интерферона, пропускание раствора через колонку с иммуносорбентом (пришитыми моноклональными анти- телами, рис. 159).

12. элюция интерферона с последующей хроматографией на целлюлозном катионообменнике.

_ш

Рис. 159. Схема очистки *рекомбинантного интерферо- на с помощью моноклиналь- ных антител (МкАТ): 1 - диа- лизат с интерфероном и дру- гими бактериальными белка- ми, 2 - интерферон, 3 - балла- 2 стные белки, 4 - МкАТ, 5 - интерферон, связывавший с МкАТ, 6 - слабая кислота.

Из указанных 12 стадий только 8 последних фактически реа- лизуются в производственных условиях, тогда как первые 4 стадии выполняются в лабораторных условиях. Кстати сказать, эти 4 стадии наиболее трудные и сложные (рис. 160).

р ВК322

ДНК

Рис. 160. Этапы клониро- вания гена интерферона: мРНК - интерфероновая мРНК из индуцированных клеток, кДНК1 - комплемен- тарная ДНК однонитевая, кДНК2 - комплементарная ДНК двухнитевая, 3 - обрат- ная транскриптаза, 4 - синтез двуспиральной кДНК, 5 - кон- цевая трансфераза, 6 - ре- стрикция, 7 - кДНК с липкими концами, 8 - отжиг, 9 - интер- фероновая ДНК, 10-включе- ние в клетки Е.соИ плазмиды- химеры, КО - клонирование • и отбор колоний, содержа- щих клетки с заданными плазмидами, БРП - "библио- тека" рекомбинантых плаз- мид.

Бактерии с генами интерферона человека продуцируют специ- фический белок в количестве 200—250 мкг/л бактериальной сус- пензии. Кроме Е. соп удается получать человеческий интерферон с помощью Вас. виЬгШв, способную секретировать синтезируемые белки в окружающую среду (у Е. соп они накапливаются в

периплазматическом пространстве), а также с помощью Засспагогпусев сегелааае, растущих на средах с более дешевыми субстратами, на них не действуют фаги, они крупнее бактерий и легче сепарируются, в их клетках осуществляется процессинг преинтерферонов. Применяют также культуры бактерий из родов МеШуютопаз, Рвеийотопав, 5а1топе11а. Все названные микроор- ганизмы конститутивно (не адаптивно) образуют интерфероны, не отличающиеся от природных. Против всех классов интерферонов получены моноклональные антитела, с помощью которых проводят быструю и высококачественную очистку продуктов, применяя иммуноафинную хроматографию.

В молекуле интерферона имеются два консервативных домена — один локализуется на №1 2-конце, а другой — на СООН-конце. Первый, очевидно, помогает связыванию с рецептором на повер- хности клетки, а второй—моделирует это связывание и опосредует другие биологические функции.

Интерфероны а, В, и у иммунологически различны и, напри- мер, а-антисыворотка не инактивирует гетерологичные интерфе- роны.

Интерфероны обладают двумя типами биологической активно- сти — противовирусной и противоклеточной. В отношении виру- сов действие трех интерферонов сравнимое по эффективности, но в отношении клеток более активен интерферон у, причем против опухолевых клеток он активнее, нежели против нормальных кле- ток.

На практике интерфероны применяют при вирусных инфек- циях, ревматоидном артрите (интерферону), при иммунопатологии и в онкологии.

11.5. Получение и использование гомо-, гетеро- и синкариоти- ческих гибридов. Материалы этого раздела базируются на данных по геномной инженерии и, в частности, на клеточной инженерии, или соматической гибридизации.

Понятия о гомо- и гетерокарионах чаще относили к дейтеро- мицетам и некоторым другим грибам, которым присущ так назы- ваемый парасексуальный процесс размножения. При этом наблюдается слияние (копуляция) нитей одного и того же или

562

различных типов спаривания, происходит объединение в одной клетке содержимого протопластов, включая ядра. Так возникают гомокарионы и гетерокарионы, функционирующие самостоятель- но, не сливаясь. Образующиеся в результате деления "дочерние" ядра распределяются по мицелию. Время от времени такие ядра сливаются, затем делятся при помощи меойза. Слившиеся ядра называют синкарионами.

Владея техникой клеточно-инженерного эксперимента, можно искусственно получать гомо-, гетеро- и синкариотические особи. Это нашло воплощение, например, в иммунобиотехнологии. Им- мунобиотехнология является составной частью биотехнологии и связана с получением и производством иммунопрепаратов, обла- дающих свойствами антигенов или антител. Теоретической базой ее является учение об иммунитете, практической базой — иммун- ная система макроорганизма.

11.5.1. Основные представления об иммунной системе. Иммун- ная система — это система органов и клеток, реагирующая на генетически чужеродную информацию и участвующая в защите макроорганизма от такой информации. Иммунная система во взаимодействии с другими системами (нервной, эндокринной, сердечно-сосудистой, пищеварительной и др.) обеспечивает защи- ту организма от внедрения и развития в нем патогенных микробов (вирусов, бактерий, грибов, протозоа), а также от воздействия антигенов разной другой природы и специфичности (тканевые трансплантаты; растительные и животные яды; аутоантигены, опу- холи). Она выполняет функцию иммунологического надзора во благо поддержания постоянства внутренней среды (гомеостаза) макроорганизма, обеспечивая его целостность и индивидуальность.

Иммунная система состоит из трех главных компонентов: клеточного, молекулярного и генетического. Первый из них вклю- чает макрофаги, Т- и В-лимфоциты, второй — пять классов иммун- ных глобулинов (1д): 1дМ, 1дС, 1дА, 1дЕ, 1дО, третий — множество генов (таблица 58).

Примечание: *Н1А — от англ. Ншпап Ьеисосу1е Атадеп. МНС состоит из 11 генов, расположенных в Б-й паре хромосом.

Иммунная система — одна из самых гетерогенных и сложных систем организма. У человека она включает примерно 2 • 10¹² лимфоцитов и 10²⁰ молекул антител, обладающих с одной стороны

564

общностью организации, а с другой -—различной специфичностью.

В характере иммунного ответа исключительная роль принадле- жит кооперативным взаимодействиям иммунокомпетентных кле- ток (ИКК) — макрофагов/лимфоцитов и вспомогательных дендрит- ных клеток. ИКК содержатся в периферической крови, селезенке, лимфоузлах, зобной железе и, следовательно, кооперативные вза- имодействия ИКК могут иметь место в различных частях тела. В таких взаимодействиях ведущую роль играют поверхностные ан- тигены, кодируемые Н1А; в них принимают также участие различ- ные медиаторы (посредники), или цитокины (рис. 161). К цитоки- нам относят разнородные вещества, участвующие в физиологиче- ских и патофизиологических реакциях лейкоцитов„и других кле- ток, и называемые клеточными регуляторами.

Цитокинам присущ ряд общих признаков: они низкомолекулярны (ММ менее 80 кДа) и гликозилированы, действуют в пикомольных (пМ) концентрациях, выделяются местно и непостоянно, выступа- ют как паракринные или аутокринные (но не эндокринные) фак- торы (от греч. кппо — отделяю; рага — возле, при; аигоз — сам; епсюп — внутри), взаимодействуют с высокоафинными рецепто- рами на клетках, изменяют спектр клеточных РНК и функциональ- ную активность клетки после взаимодействия с рецепторами, регулируют силу и продолжительность реакций воспаления и иммунитета. Отдельные цитокины проявляют множественную ак- тивность; ответ на цитокины зависит от их концентраций и типов клеток. К тому же они взаимно индуцируют секрецию друг друга, проявляя то синергизм, то антагонизм. Так, например, биологиче- ская эффективность интерлейкинов (ИЛ) 1 и 6 опосредуется друг другом.

К настоящему времени описано более десятка цитокинов, включая лимфокины, монокины, интерлейкины, интерфероны и др. Только интерлейкинов известно 13, первый из них ИЛ-1 открыт в 1972 г., образуется макрофагами; ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-5, ИЛ-7, ИЛ-8 и ИЛ-9 — Т-клетками; ИЛ-4 — активированными Т-клетками, некоторыми линиями В-клеток и тучными клетками; ИЛ-6 — различными клетками и является интерфероном 3-2. Не все ин- терлейкины изучены с одинаковой глубиной, поэтому приводимая характеристика их неравноценна.

ИЛ-1 стимулирует пролиферацию тимоцитов, рост и диффе- ренцировку стволовых клеток, активирует Т-хелперы и В-клетки, индуцирует миграцию лимфоцитов; его ММ 12—18 кДа.

ИЛ-2 называют еще Т-клеточным ростовым фактором. Он активирует Т-клетки, стимулирует дифференциацию и пролифе- рацию В- и Т-клеток, повышает функцию клеток-киллеров, акти- вированных лимфокинами.

ИЛ-3 повышает колониеобразование костно-мозговых клеток, стимулируя гемопоэз, функцию эозинофилов и клеток-киллеров, активированных лимфокинами.

ИЛ-4, или фактор 1, стимулирующий В-клетки. Он модулирует переключение синтеза классов 1д. ММ его 15 кДа в негликозили- рованной форме и 20 кДа — в гликозилированной; индуцирует синтез 1дЕ, выполняя при этом хелперную функцию, экспрессию Рс-рецепторов.

ИЛ-5 — гликопротеин с ММ 45—60 кДа, усиливает дифферен- циацию В-клеток в плазматические клетки на последней стадии,

566

секрецию 1дА 1дА-несущими клетками, пролиферацию эозинофи- лов и активацию их зрелых форм.

ИЛ-6 (В-клеточный^ фактор дифференциации, гибридомный ростовый фактор, гепатоцитарный стимулирующий фактор: ин- терферон Р-2) стимулирует В-клеточную дифференциацию. Он включает 184 аминокислоты. ММ его 26 кДа, индуцирует секрецию 1д В-клетками, рост гибридом, плазмацитом, проявляет синергизм с ИЛ-1, ИЛ-3 и фактором некроза опухоли (ТЫР). Предполагают, что ИЛ-6 является ключевым веществом в семействе цитокинов.

ИЛ-7, содержащий 154 аминокислотных остатка, индуцирует селективную дифференцировку пре-В- в В-лимфоциты. Ген ИЛ-7 включает 6 экзонов и 5 интронов.

ИЛ-8, или фактор хемотаксиса нейтрофилов, активирует ней- трофильные сегментоядерные лейкоциты.

ИЛ-9, или цитокин Р40 индуцирует миграцию лимфоцитов. Ген ИЛ-9 содержит 5 экзонов.

Таким образом, лишь на примере 9 интерлейкинов видна сложность регуляторных механизмов, включающихся в управле- ние взаимодействиями клеток иммунной системы. Очевидно, что т лото имеется много других регуляторов (цитокинов), которые будут открыты в ближайшие годы.

Познание и использование функций компонентов иммунной системы на молекулярном уровне называется молекулярной им- мунологией. На этом уровне теперь исследуют антигены и анти- тела, их взаимодействия; рецепторы различных клеток иммунной системы; гены и генетическое обеспечение этой системы.

В течение 1982—1986 гг. было проведено три Международных рабочих совещания, посвященных поверхностным лейкоцитарным дифференцирующим антигенам, обозначенным СО-антигенами (от первых букв в английских словах С1ив1ег Шйегешлаиоп — групповая дифференциация). Некоторые авторы используют обоз- начения СО в качестве ссылки на антиген, например СО-2 — синоним ТП антигена и т. д. Другие используют СБ-номер для того, чтобы указать на антитела, определяющие антиген.

В целях определения СО-антигенов используют 3 главных метода с моноклональными антителами: иммунофлуоресцентный, иммуноосадочный (иммунопреципита- ция) и иммуногистологический на тканевых срезах. К началу 90-х годов было определено 78 СО-антигенов (С01—С078), часть из которых представлена в таблице 59.

Благодаря анализу рецепторов обнаружены так называемые "двойные отрицательные (ОМ) Т-клетки", содержащие у/8-рецеп- торы, контактирующие с СМ рецепторами на а- и 3- Т-клетках, но не имеющие СБ4 и СЭ8 рецепторов. Таких лимфоцитов мало в тимусе и еще меньше в других лимфоидных тканях (не более 1%). Считают, что эти Т-клетки выполняют контролирующие фун- кции на поверхности эпителия (в частности, кишечника) и поэтому их называют эпителиальными лимфоцитами.

Молекулярный компонент иммунной системы, представлен- ный пятью классами иммуноглобулинов, формируется за счет клеток В-ряда (в частности, плазматических), кооперативно взаи- модействующих с некоторыми другими ИКК (см. рис. 161).

М олекулы антител построены, в основном, по единому плану (рис. 162). Несмотря на огромное разнообразие антиген-связыва- ющих мест, вариабельная часть молекул антител представлена 5—6 каноническими вариантами пространственной укладки и, как по- лагает К. Милстейн (1990), мно- гообразие их репертуара обус- ловливается комбинаторикой канонических структур в соче- тании с точковыми заменами аминокислотных остатков в ан- тиген-связывающих центрах.

Рс

^

8

X

Рис. 162. Схематичное строение мо- лекулы антитела 1дС1 человека: 1 — иди- отип, 2 — изотип, 3 — аллотип, Па — расщепление папаином, Рс — фрагмент, РД —. фрагмент, С — константная об- ласть, У — углевод, V — вариабельная § область, Н — тяжелая цепь, v — легкая

¹ 5С,'1 ^цопь-

Являясь белками сыворотки крови, строго специфичные анти- тела образуются после стимулирования иммунной системы соот- ветствующим антигеном. Благодаря своей исключительной специ- фичности (за счет V областей), антитела находят все более широкое применение не только в фундаментальных исследованиях, но и в практике выделения и очистки различных антигенных веществ, в профилактике, диагностике и лечении многих заболеваний.

11.5.2. Получение моноклональных антител (МкАТ). Вводимый или попадающий в организм антиген признается и перерабатыва- ется макрофагами, затем антигенная информация представляется лимфоцитам, содержащим рецепторы. Так, в частности, стимули- руется формирование клонов плазматических клеток, продуциру- ющих специфичные антитела. Качество и количество антител зависят от качества и дозы антигена, способа его введения в организм, от вида животного — реципиента. Однако при традици- онной технологии удается получать преимущественно гетероген- ные антитела. В то же время "жизнь диктовала" необходимость получения моноклональных антител — продуктов единого клона клеток. Важным шагом к этому было открытие Портера в 1972 г., связанное с установлением "антительной природы" парапротеинов в сыворотке крови людей и животных с опухолевым поражением лимфатической системы (миелома). Миеломные клетки представ- ляют собой трансформантов плазматической клетки, продуциру- ющих моноклональные антитела. К сожалению, антиген при этом до сих пор остается неустановленным. Тем не менее, факт обра- зования моноклональных антител миеломными клетками был ре- шающим в создании гибридом, с помощью которых сделан огром- ный скачок в иммунобиотехнологии. Выдающийся вклад в это внесли Г. Келер и К. Милстейн (1975), разработавшие метод получения МкАТ желаемой специфичности и в большом количе- стве.

Теперь известно, что каждой антигенной детерминанте соот- ветствует свой клон В-клеток — антителопродуцентов (в организме человека имеется в среднем 10⁷ клонов В-клеток). Отсюда и происходит понятие о МкАТ.

Келер и Милстейн слили мышиные миеломные клетки РЗ-Х63- Ад8, культивируемые т лагго, с лимфоцитами селезенки иммуни- зированной овечьими эритроцитами мыши. При слиянии образо- вывались гомо(ди-, поли)кариотические гибридные клетки — гиб- ридомы, сохраняющие признаки обеих родительских особей, а именно — способность к неограниченному росту т лагго и т лалго (признак миеломной клетки) и способность продуцировать специ-

570

фичное антитело (признак В-лимфоцита). Названием "гомо(ди-, поли)кариотические гибрид омы" подчеркивается факт происхож- дения клеток от одного вида животного. Принципиально этот метод пригоден для получения антител против любого антигена.

Таким образом, при традиционных методах получения антител после иммунизации животных имунные глобулины оказываются, как правило, поликлональными, тогда как с помощью гибридом получают МкАТ.

Однако следует помнить, что не все клетки подвергаются соматической гибридизации — специализированные функции ро- дительских партнеров сохраняются лишь в том случае, если эти клетки находятся на одной и той же стадии деления. Другие клетки остаются неслившимися или сливаются с гомологичными особями. Этапы получения гомо-, гетеро- или синкариотической гибридомы являются следующими:

1) иммунизация антигеном (например, мыши),

2) взятие клеток селезенки (лимфоциты — плазматические клетки) от иммунной мыши,

3. отбор миеломных клеток,

4. слияние клеток—получение гетерокариотических гибридом,

5. селекция гибридов,

6. клонирование гибридов,

7) накопление т \чуо или т \ч1го антител и их выделение. Клетки — гибридомы можно сохранять в замороженном виде,

например в 1% диметилсульфоксиде, или вначале их суспендируют в смеси 5% диметилсульфоксида и 95% сыворотки в концентрации 10⁶ — 10⁷ клеток/мл. Замораживают при — 70°С и хранят в жидком азоте.

Теперь имеются линии клеток, которые сохраняются в течение ряда лет без потери способности выделять 1д. Но есть и коротко- живущие линии; у таких мышиных линий обычно вначале исчезает тяжелая цепь 1д (утрата 12-й хромосомы), а затем — легкая цепь 1д (потеря 6-й хромосомы).

В целях получения гибридом используют разные линии мие- ломных клеток (таблица 60), из которой видно, что более прием- лемыми линиями являются 8226АК./М Р4-1 и 5р 2/0, не продуци- рующие 1д. Следует иметь в виду и тот факт, что гибридомы легче получаются при использовании клеток от одного вида животного (гомокариотические гибриды). Межвидовые гибридизации (гете- рокариотические гибриды) всегда мало удачны, так как один из

571

партнеров в гибридоме теряет ряд хромосом, включая и те из них, которые контролируют образование 1д. И все же стабильные гетерокариотические межвидовые гибриды удается получать, на- пример, при слиянии миеломных клеток мышей с крысиными лимфоцитами.

Таблица 60. Линии некоторых миеломных клеток, рекомендованные для получения гибридом

Происхождение	Название		Образуемые цепи 1д
	полное	сокращенное	легкие	тяжелые
человеческая	8КО-007 (и=266АИ	—	X	3
—"—	СМ15006ТС- А12	—	к
— -	РРШ-8226	8226АК/ N№4-1
крысиная 1ХУС	210.КСУЗ. ,Ад1.2.3	УЗ	к	—
мышиная ВАХВ/с .	Р3-Х63-Ад8	Х63	к	у1
	РЗ-К51/1- Ад4-1	N5-1	к +	—
—"—	5р2/0-Ад14	5р2/0	—	-
— —	МРС-11-Х45- -6ТС1.7	Х45	к	У2Ъ ■ 1

^{Примечание: + легкая цепь только образуется, но не выделяется.}

Образование гомо(ди-, поли)кариотической клетки является лишь первой ступенью к возникновению гибридомы. В последую- щем, после первого митоза, ядра сливаются и образуются синка- риотические гибридные клетки. Однако замечено, что лишь гиб- ридомы с неслившимися ядрами могут развиваться дальше. Если родительские партнеры при этом различались по фенотипу, то соматический гибрид имеет смешанный фенотип.

В 1980 г. Л. Олссон и X. С. Каплан; К. М. Кроус, А. Линенбах

572

и др. сообщили о получении миеломных линий от людей, пригодных для накопления и выделения человеческих МкАТ (см. таблицу 60).

В целях получения лимфоидных клеток животному (мыши) вводят внутримышечно или внутрибрюшинно антиген в дозе при- мерно 5-^200 мг в расчете на чистый белок. В ответ на сильныр антиген в селезенке 0,05% клеток секретируют 1дМ и 1дС в соотношении, близком 10:1 из примерно 1% всех секретирующих клеток. Через 3—4 недели повторно вводят 10—100 мкг антигена. В течение последующих 2—4 недель проверяют титры антител и затем перед экстирпацией селезенки в течение нескольких дней вводят внутривенно небольшие дозы антигена для активации В-лимфоцитов. Могут быть приняты и другие схемы иммунизации.

Для целей соматической гибридизации необходимы также миеломные клетки мышей. Обычно используют линию ВАЫЗ/с, от которой была получена перевиваемая миелома МОРС-21 (от англ. Мтега1 Он—тйисей Р1азтосу1:оте 21). При этом необходимо:

1) наличие у клеток селективного маркера устойчивости к определенному ингибитору, например, к 8-азагуанину, к бромде- зоксиуридину и др.; клетки, устойчивые, к 8-азагуанину, не содер- жат фермента гипо-

_ХУ'

вг ксантингуанинфос форибозилтранс- феразы (ГТФРТ) и он-сн₂ / поэтому не способ-

ны использовать экзогенный гипо- ^_н ксантин для синте-

за пуринов. ГТФРТ броцдюмсиуридин катализирует реак- цию взаимодейст- ^м****^.° - вйя гипоксантина и

гуанина с 5'-фосфо-

рибозил-1-пирофосфатом с образованием соответствующих нук- леотидов — инозин-5'-фосфата и гуанозин-5'-фосфата. Клетки, устойчивые к бромдезоксиуридину, не обладают ферментом тими- динкиназой (ТК); ТК катализирует реакцию превращения тимиди- на в тимидин-5'-фосфат;

2) отсутствие образования нежелательных легких или тяжелых цепей 1д (происхождение их может быть "миеломное"или "селезе- ночное").

—он

Иг1Г

он

Последний этап на пути к собственно технологическому про- цессу накопления МкАТ заключается в экстирпации селезенки из организма мыши и получение В-клоток. Это осуществляют через 3—4 дня после последнего введен 1,1 антигена.

Изолированную селезенку помещают в чашку Петри со средой, содержащей сыворотку крови и ее промывают (перфузируют). Клетки центрифугируют, эритроциты лизируют, лимфоциты сус- пендируют в среде Дальбекко без сыворотки и проверяют их на жизнеспособность.

На следующем этапе смешивают примерно 10⁷ миеломных клеток с 10⁸ клеток селезенки. Клетки в среде без сыворотки выдерживают 45 мин., центрифугируют в конических пробирках. Супернатант удаляют, осадок встряхивают и к нему добавляют 2 мл. 40% полиэтиленгликоля (ПЭГ) с ММ примерно 1,5—4,0 кДа, поддерживают температуру 37°С, рН среды 7,6—7,8, выдерживают 30 мин., затем в течение последних 7—8 мин. добавляют среду Дальбекко с фетальной телячьей сывороткой (5—15%). Клетки в разведенном ПЭГ осаждают, ресуспендируют в 30 мл. гибридомной среды с сывороткой и распределяют в лунки объемом 2 мл для микротитрования. При необходимости среду заменяют на свежую (среда с гипоксантином и тимидином). В среду добавляют клетки- фидеры, или "кормилки" (от англ. геейег — приток, питатель) — преимущественно перитонеальные макрофаги, индуцированные минеральными маслами) и 1% карбоксиметилцеллюлозу. В качест- ве индукторов слияния клеток можно использовать вирус Сендай, температурный шок, электроразряд и др.

В смешанной популяции из миеломных и селезеночных клеток возможно возникновение нескольких типов гетерокарионов: